Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Osteoklastlar vardır benzersiz kemik-resorbing kemik iliği monosit/makrofaj soyundan hücre. Osteoklastlar disfonksiyon kemik metabolik hastalıkları, osteoporoz da dahil olmak üzere bir dizi neden olabilir. Patolojik kemik kayıplarının önlenmesi için ilaç hedefleri geliştirmek için hangi precursors Osteoklastlar ayırt mekanizmaları anlaşılması gerekir. Yeteneği yalıtmak ve çok sayıda Osteoklastlar vitro kültür Osteoklast ayrımında belirli genlere rolünün belirlemede önemlidir. İnactivation rapamycin karmaşık 1 (TORC1) Osteoklastlar içinde memeli/mekanik hedef Osteoklast kaç azaltın ve kemik kütlesi artırmak; Ancak, temel mekanizmaları daha fazla çalışma gerektirir. Bu da çalışmanın, ayırmak ve fare kemik iliği dan Osteoklastlar kültür ve mTORC1 inactivation Osteoklast oluşumu üzerine etkisi çalışmaya RANKL tabanlı bir protokol açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı, genellikle bir hafta içinde çok sayıda dev Osteoklastlar, başarıyla sonuçlandı. Raptor silinmesiyle Osteoklast oluşumu Engelli ve o mTORC1 Osteoklast oluşumu için kritik olduğunu belirten salgı tartarat dayanıklı asit fosfataz aktivitesini azalmıştır.
Giriş
Kemik değişen bir organdır ve dokusunu ve hayatı boyunca Osteoklastlar tarafından yenilenmiş. Osteoklastlar mineralize matris rezorpsiyonu için sorumlu ve dokusunu sentez ve yeni kemik matrisler1salgılar. Kemik rezorpsiyonu ve kemik oluşumu arasındaki dengeyi kemik bakım da dahil olmak üzere Kemik sağlığı için önemlidir kütle ve stimülasyon ve yaralanma yanıt. Bu denge bozulur, bir dizi metabolik kemik hastalıkları, Osteoporoz ve periodontal hastalıkları da dahil olmak üzere meydana gelebilir. Bu hastalıklar, kemik dokusunu2,3kapasite şekillendirme mediatörlerin kemik rezorpsiyonu kayna....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanlarla ilgili tüm yordamlar Stanford idari Panel üzerinde laboratuvar hayvan bakım (APLAC) tarafından onaylanmış protokolüne göre gerçekleştirilen ve hayvan bakım ve kullanım Komitesi Shanghai Enstitüsü Biyokimya ve hücre tarafından kabul edildi Biyoloji.
1. hazırlık
- Osteoklast belirli Raptor silme fareler (Raptorfl/fl; oluşturmak Ctsk-cre, ahiret CtskRap) Ctsk-cre fareler ile Raptorfl/fl fareler çiftleşme tarafından. Bu çalışmada WT denetimi olarak Raptorfl/fl fare kullanın.
- Bir konteyner ile izole kemik tut....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mevcut iletişim kuralını kullanarak, çok sayıda dev Osteoklastlar gün 6 görüldü; Dev Osteoklastlar görülmez, bir gün daha Osteoklast farklılaşma olabilir (şekil 1) gerekli. Başarılı Osteoklast oluşumu (şekil 2A) Boyama tuzak tarafından doğrulandı. Osteoklastlar 3'ten fazla çekirdeği dev şarap kırmızı/mor hücrelerle vardı. 250'den fazla Osteoklastlar WT BMMs (şekil 4A) 96-şey plaka her şey elde edilmi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Osteoclastogenic tahlil yalıtmak ve Osteoklastlar vitro12,13kültür için en çok kullanılan yöntemdir. Ise birkaç RANKL tabanlı Osteoklast indüksiyon açıklanan13,14,15olabilirdi, bu da çalışmanın bir iletişim kuralı önceki yöntemleri üzerinde temel bazı değişikliklerle nitelendirdi.
Önceki çalışmada, BMMs hemen yalıtım.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ellerinde devlet.
Teşekkürler
Dr. Minghan Tong ve S. Kato yazarlar nazikçe sağlayan reaktifler ve fareler için teşekkür ederiz. Biz yararlı tartışmalar Zou laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. Bu eser kısmen hibe tarafından desteklenmiştir 973 Çin Bakanlığı bilim ve Teknoloji (çoğu) [2014CB964704 2015CB964503], 9 insanların Hastanesi, Shanghai Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi klinik araştırma programı Program. Hücre biyolojisi ve çekirdek tesis Kimya Biyoloji, moleküler hücre bilim, Shanghai Enstitüsü biyokimyası ve hücre biyolojisi, Çin Bilimler Akademisi mükemmelliği CAS merkezi çekirdek tesis yardım için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Raptorfl/fl fareler | Jackson Laboratuvarı | 013188 | |
| Ctsk-cre fareler | S. Kato, Tokyo Üniversitesi, Tokyo, Japonya | ||
| &-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamin | Gibico | 25030081 | |
| Penisilin streptomisin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal buzağı serumu | BioInd | 04-001-1A | |
| Rekombinant fare M-CSF proteini | R& D | Q3U4F9 | |
| Rekombinant fare RANKL proteini | R & D | Q3TWY5 | |
| RBC lizis tamponu | Beyotime | C3702 | |
| Tripan mavisi | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Aseton | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| Sitrat çözeltisi | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehit çözeltisi | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| Asit Fosfataz, Lökosit (TRAP) Kiti | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Hızlı Garnet GBC Baz çözeltisi | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodyum Nitrit Çözeltisi | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Fosfat Çözeltisi | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Asetat çözeltisi | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartarat çözeltisi | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartarik asit | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodyum tartrat dibazik dehidrat | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glisin | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| MgCl2 | Şangay Kimya Ltd. Şti. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| NaOH | Şangay Kimya Co., Ltd. | ||
| Fosfataz substrat | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Hücre Sinyal Teknolojisi | 2280 | |
| anti-P-ribozomal protein S6 (S235 / 236) | Hücre Sinyal Teknolojisi | 2317 | |
| anti-ribozomal protein S6 | Hücre Sinyal Teknolojisi | 2211 | |
| anti-β-aktin | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-130300 | |
| %37 formaldehit | Xilong bilimsel | ||
| poliviniliden florür (PVDF) membran | Bio-Rad | ||
| Western Kemilüminesan HRP Yüzey (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0,45 mm Şırınga | |||
| Makas | |||
| Sivrisinek forsep |
Kaynaklar
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
