巢式 PCR 是一种灵敏的、特异的、直接的技术, 可以应用于蜱 DNA 提取物来探测莱姆病的致病剂螺旋体螺旋体。最初的 PCR 实验使用基因特异的引物产生长的增, 然后成为模板为随后反应使用内部引物。
莱姆病是一个严重的传染媒介感染, 是由螺旋体螺旋体严格广义家庭螺旋体, 这是通过叮咬感染的蜱蜱传给人类。北美洲的主要病因病原体为螺旋体螺旋体。随着地理风险区域的扩大, 谨慎的做法是, 支持能够测量蜱感染率的强健的监视计划, 并将调查结果传达给临床医生、兽医和公众。嵌套聚合酶链反应 (nPCR) 的分子技术早已用于这一目的, 它仍然是检测蜱和野生动物中的螺旋体的中心、廉价和健壮的方法。
本文说明了 nPCR 在 DNA 提取物中的应用, 以识别感染的标本。两个独立的b. 螺旋体目标, 编码鞭毛 b (松弛) 和外表面蛋白 A (OspA) 的基因, 已广泛使用此技术。该协议涉及蜱收集, DNA 提取, 然后第一轮 PCR 检测每一个螺旋体特定的基因座。随后的聚合酶链反应 (PCR) 使用第一反应的产品作为一个新的模板, 以产生更小的, 内部放大片段。嵌套方法提高了常规 PCR 的特异性和灵敏度。当从两个螺旋体基因的内增可以通过琼脂糖凝胶电泳检测时, 病原体的蜱被认为是阳性的。
Lyme 疾病 (LD) 是最普遍的传染媒介传染在北半球, 并且它的发病率继续增加1。这种衰弱的疾病是由 spirocheteal 的病原体的莱姆疏 (LB) 复合体 (通常称为螺旋体螺旋体狭义广义, 或广义), 其中历史上包括主要的北美洲病原体, B。螺旋体严格意义上的 (s), 除了b. afzelii和b. garinii,在欧洲和亚洲广泛存在, 并且是新兴临床相关性的物种2,3。这些细菌通过叮咬被传染的蜱滴答声2被传染给人.虽然主要北美洲传染媒介是i. scapularis和i. pacificus, 这个属中的多个物种已被发现窝藏和传播细菌4。在人类中, B. 螺旋体可导致多症状影响皮肤、关节、心脏、神经系统、内分泌腺体、胃肠道和内脏器官5、6、7, 8、9、10。疾病控制和预防中心目前每年估计超过30万新的人类病例在美国11,12。虽然在早期诊断和治疗疾病时, 预后往往是有利的, 但研究表明, 在10% 和60% 的患者中, 接受推荐的抗生素方案的病人在治疗后继续出现症状停止, 在一种现象被称为后处理 Lyme 疾病综合征 (PTLDS)13,14,15。此外, 临床干预的延迟可能是由于缺乏对蜱叮咬的认识、对最初疾病的非特定表述, 以及在感染开始时使用的传统血清学诊断方法的低灵敏度造成的。如果不能迅速而适当地治疗, 就能使症状进展在日益衰弱的并发症中表现出来16,17。因此 Lyme 疾病预防是风险管理的基石。对付这一日益严重的威胁的战略包括强有力的监测措施, 以表明蜱虫病的流行程度, 并确定关注的地理区域。
本文展示了嵌套聚合酶链反应 (nPCR) 作为一种分子筛查工具的效用, 用以识别感染蜱。为了提高特异性, 两个螺旋体基因用于平行放大。鞭毛 B (松弛)对鞭毛18的主要灯丝蛋白进行编码, 而该基因位于单个线性染色体上, 而外表面蛋白 a (OspA) 的脂蛋白产物介导蜱中肠殖民化, 并且是质粒编码的19,20。该工作流包括蜱收集, DNA 提取, 然后第一轮 PCR 检测螺旋体特定的基因座。随后的 PCR 将第一反应的产物作为一个新的模板来生成更小的、内部的放大片段。当从两个螺旋体基因的内增可以通过琼脂糖凝胶电泳检测到螺旋体螺旋体时, 蜱被认为是阳性的。
nPCR 技术, 和松弛和OspA基因目标, 已被广泛用于生态监测和临床检测的莱姆螺旋体自二十世纪九十年代代初2122,23 ,24,25。在分子协议的发展之前, 蜱被评估通过服从肠道内容对反螺旋体免疫荧光 (如果) 染色, 微生物培养或它的组合26。这些方法受到固有的限制, 包括螺旋体27的缓慢增长和吹毛求疵的性质、抗体性能问题, 以及如果处理21的活蜱的要求。随后采用 PCR 技术对感染病媒进行快速、灵敏、特异的鉴定。它提供了明显的改进传统方法, 包括独立于文化的直接应用到不同的标本类型, 如死和存档蜱, 否则将不适合测试21,22.嵌套实验设计通过在连续两轮放大2528中使用两组不同的基因特异引物, 进一步提高了经典 PCR 的特异性和灵敏度。
实验成功的关键在于战略基因的选择和增的设计。为了准确估计螺旋体螺旋体的存在, 引物应在螺旋体属中检测到与复发发热螺旋体的相关病原体, 而不进行交叉反应。在松弛的情况下, 这种特异性是通过针对基因的可变内部区域来实现的, 而不是由不同细菌 (图 1)24,29所共享的相对保守的侧翼序列。,30。
图 1: nPCR 的概念, 如所示使用螺旋体松弛基因作为目标.基因的5和 3 ‘ 总站是共同的对有机体在螺旋体螺旋体广义之外, 使这些区域不适合对 Lyme 导致的病原体的具体评估。采用不太保守的内部序列作为引物靶, 进行两轮 PCR 检测最终的内部增。请单击此处查看此图的较大版本.
在测试他们的歧视性能力, 内部的松弛底漆评估了80不同的螺旋体隔离, 并发现只识别那些与莱姆病相关的24。nPCR 的较低检测限度已记录在六24和十31细菌从纯文化, 虽然灵敏度可以进一步改善南部印迹的增, 并杂交 radiolabelled 或化学发光探针。耦合技术将检测阈值减少到单个螺旋体31。通过直接比较, 发现常规的 unprobed 单圆 PCR 报告至少存在 104螺旋体31。然而, 应该指出的是, 在处理复杂的环境和临床样本时, 由于不相关的 DNA 和潜在的抑制物质的存在, 化验灵敏度会降低。这些挑战在很大程度上可以通过使用 nPCR 来规避。
尽管分子技术在过去的几十年中取得了进展, nPCR 仍然是现代监测工作的主要技术。如果在这个协议的设计和执行中被注意到, 它是一种强大的、适应性强且相对简单的方法来捕获病原体在蜱媒中的存在。
经过几十年的使用, PCR 技术一直证明它们的价值, 在检测螺旋体从节肢动物和哺乳动物标本, 无论是螺旋体来自环境或临床来源。PCR 提供了许多改进前的现有方法的监测。值得注意的是, 它不依赖于抗体试剂的开发和性能, 而是可以简单地通过修改底漆序列来检测新的感兴趣的目标。PCR 也可以独立地或通过复用反应对多个基因座进行平行的评估。它可以应用于不同的标本输入, 包括新鲜和存档蜱22, 动物或人体体液, 和切除组织25。PCR 也产生增, 可以进一步处理, 例如通过限制酶消化, 探针杂交, 或测序, 以提供更多的洞察微生物的身份21。
作为一种临床工具, PCR 在概念上比标准的血清学诊断更可取, 因为它提供了细菌存在的直接指示, 而不是依赖于宿主免疫应答作为继发性措施。然而, 莱姆疏是与一个相对适中的微生物负担 (< 50 生物体/毫升的尿或血浆) 和瞬态 spirochetemia, 这可能导致假阴性结果25。该技术在临床上的敏感性因组织类型、感染阶段和样本状况的不同而有很大差异, 在现有的血液、脑脊液和活检组织的研究中, 在12.5% 和62% 之间下降了36。如果 PCR 是在细菌培养之后进行的, 那么分子敏感性限制就不是一个问题, 然而从临床标本中恢复可行的螺旋体也同样具有挑战性。只有最近才对协议进行了优化, 以获得更高的收益率35。同时, 受感染的成人蜱的肠道平均可以从2000到 5万螺旋体37,38,39, 这是在 nPCR 的检测范围内稳固。因此, 该议定书非常适合于监测工作。
尽管它有许多优点, nPCR 确实带来了某些挑战, 因此, 这种技术准确报告蜱感染的能力取决于基因的战略选择和增, 细致的实验工作流程, 以恢复质量的 DNA从标本, 同时尽量减少交叉暴露样品, 并使用适当的控制, 可以报告污染物在实验室环境和试剂。在进行任何试验之前, 应明确界定调查的范围和意图, 以便能够选择适当的基因所在地和其中的区域。如果目标是为莱姆导致的螺旋体螺旋体广义复数提供一个无偏的屏幕, 则应创建底漆, 以检测具有相似亲和力和放大效率的所有相关菌株, 而不捕获无关有机体25。新的引物可以设计和评估在硅片使用的软件工具, 如底漆爆破40, 虽然它们也应该在实验中对标准参照分离器进行验证, 然后再应用于 uncharacterized 样品。DNA 提取过程的目的是从混合环境样品 (蜱匀浆) 中回收完整的微生物模板。在进行 PCR 之前的一个可选步骤是评估提取的 DNA 的完整性。此外, 还可以设置平行反应, 以在蜱中的一个看家基因为目标。后者的方法也可以表明在反应混合物中存在抑制剂, 提供了更多的信心, 消极的螺旋体反应是由于缺乏有机体, 而不是存在的抑制性污染物。
嵌套 PCR 方法的灵敏度增加, 是以产生假阳性结果的潜在污染为代价的。外源模板可以被引入到样品的蜱解剖和 DNA 恢复, 或在建立的过程中, 外部和内部放大反应。因此, 遵循最佳的 PCR 方法以避免模板或增交叉污染是特别重要的。这些措施包括使用独立的气流, 在 PCR 和生物安全柜中适当地进行隔离, 对表面和试剂进行彻底的化学和物理清洗和消毒, 并谨慎处理 DNA41. 无模板控制对于识别库存试剂的污染也是至关重要的。nPCR 的一个特殊的脆弱性是在将第一反应的产物转移到第二个 PCR 容器时发生的增处理。由于目标 DNA 在阳性样本中已经经历了指数的富集, 这一步尤其容易交叉污染, 因此开发了单管 nPCR 协议来规避这一限制。在这种方法中, 这两套引物的一个给定的基因被加在一起的反应管, 仍然密封的两个回合的 PCR31。外部和内部底漆对必须热力不同, 这样, 外部夫妇放大模板在高退火温度是禁止内引物。在第二轮, 退火温度降低, 以适应内部对。这不仅绕过了一个潜在的混淆步骤, 它还允许使用附加的防污染措施31,42。然而, 这种修改可能会牺牲一些化验灵敏度。无论采用何种方法, 增加在样本上独立进行的技术复制的数量将有助于识别杂散污染。
自从引入 nPCR 以来, 分子技术一直在不断发展, 而这些新的方法比最初的设计更有选择的优势, 尽管财政支出增加了。顾名思义, 定量 pcr (qPCR 或实时 (RT) pcr) 允许在样本中列举病原体, 而传统的技术在性质上是定性的43。据报告, qPCR 的灵敏度与 nPCR38相似, 但它可能会根据底漆特性的不同而波动28。使用分子信标 (MB) 代替常规 TaqMan 探针的 qPCR 的变体在临床标本中的螺旋体检测中也显示了希望44、45、46。由于其独特的二级结构, 分子信标产生较低的背景荧光和更高的合法信号, 从而提供了优越的灵敏度47。临床前评估建议在一个和十螺旋体44,45之间有一个潜在的检测阈值。此外, 该技术已成功应用于多重反应, 同时检测哺乳动物寄主基因44和其他蜱源性致病菌45, 这是不容易实现与 nPCR。其他设计修改包括液滴数字 PCR (ddPCR) 技术, 它可以定量的 DNA 不使用标准曲线39,48。此技术对螺旋体的较低检测限制同样是大约十螺旋体/示例39。与 nPCR 相比, 这些方法还具有降低潜在污染的优点, 因为它们只需要一个单一的放大协议。
如果监测的目的是为了描述蜱的不同细菌含量, 16S rRNA 基因筛选是一个有吸引力的选项49。虽然这种方法是昂贵的, 需要专门的 DNA 器在所有分子生物学实验室没有发现, 并要求更复杂的生物信息学为基础的解释, 它可以捕捉到更准确的微生物广泛的光谱表示载体的病原体负荷。
虽然 qPCR 及其衍生物是定量应用的选择方法, 而基因屏幕提供了蜱菌群的广泛的库存, 目标监视工作往往涉及二进制报告的存在或缺乏一个或几个病原体在一个载体。在这种情况下, 这些新的、更复杂的做法可能会给这一进程带来不必要的复杂性和财政负担。由于这些原因, nPCR 已经经受住了时间的考验, 成为蜱测试的关键技术。
The authors have nothing to disclose.
作者希望感谢卡米哈里斯的入门设计, 阿什利 McKibbon 和杰西卡托马斯-Ebbett 的拍摄, 和约翰布雷克利, 亚历山德拉福利-伊, 克里斯兰利, 朱莉刘易斯, 凯西太, 阿什利 McKibbon, 克里斯 Zinck, 和罗西的狗出现在视频.a.m.k. 得到加拿大莱姆疾病研究基金会的支持, 项目资金由加拿大自然科学和工程研究理事会 (NSERC) 提供。m.k.b. W. 收到新不伦瑞克省创新基金会 (NBIF) 的薪资资助。
LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet | Nuaire | ES AIR NU-543 | |
Razor blades | VWR | 55411-050 | 0.22 mm thickness |
Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL) | Axygen | 311-08-051 | |
AquaGenomic | MultiTarget Pharmaceuticals | 2030 | DNA extraction reagent |
Microtube Pestle | Diamed | DIATEC610-1551 | Designed for 1.5 ml tubes |
Water bath – Isotemp 202 | Fishse Scientific | 15-462-2 | |
Vortex | Labnet | S0100 CAN | |
Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge | Labnet | C2400 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B9754 | |
Primer Synthesis | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
PCR Cabinet | Misonix | PCR6-482 | |
PCR tube with attached flat caps 0.2mL | VWR | 20170-012 | |
GoTaq Green Master Mix 2x | Promega | M7123 | |
Nuclease-free water | Promega | M7123 | The water comes with the GTG |
Spectrafuge Mini | Labnet | C1301 | |
SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration | EDVOTEK | 608 | |
Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose) | FroggaBio | A87-500G | |
GD 100 bp DNA Ladder | FroggaBio | DM001-R500 | |
Electrophoresis power pack | VWR | VWR 105 | EC Apparatus Corporation |
Fluor-S MultiImager | BioRad | 170-7700 (Serial number 433B0154) | |
Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2) | BioRad | 1709600 |