유도 및 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 마이크로-CT 영상
Summary
이 프로토콜 대뇌 동굴 같은 기형 질병 마우스 모델에서의 유도 및 고 사용 대비 향상 된 병 변 부담을 측정 하기 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영. 이 방법은 분자 기초 및 대뇌 동굴 같은 기형에 대 한 잠재적인 치료 및 기타 뇌혈관 질병 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.
Abstract
돌연변이 CCM1 (일명 KRIT1), CCM2, 또는 CCM3 (일명 PDCD10) 유전자는 인간의 대뇌 동굴 같은 기형 (CCM) 일으킬. CCM 질병 마우스 모델 출생 후 동물에서 Ccm 유전자의 tamoxifen 유도 삭제에 의해 설립 되었습니다. 이 마우스 모델 분자 메커니즘 및 CCM 질병에 대 한 치료 접근을 조사 하는 귀중 한 도구를 제공 합니다. 병 변 및 진행을 평가 하는 정확 하 고 양적 방법 이러한 동물 모델의 전체 가치를 활용 하기 위해 필수적 이다. 여기, CCM 질병 마우스 모델에서의 유도 시연 하 고 대비를 사용 하 여 향상 된 마우스 두뇌에서 측정 CCM 병 변 부담 x 선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 메서드. 출생 후 하루 1 (P1), 우리 다니엘 Ccm2의 floxed 대립 유전자를 Cdh5 CreErt2 transgene에서 Cre recombinase 활동을 활성화 하기 위해 4-hydroxytamoxifen (4HT) 사용. 마우스 두뇌 병 변 CCM P8에 분석 되었다. 마이크로-CT, 뇌 조직에 대비 향상을 기반으로 하는 요오드는 Lugol의 솔루션 사용 되었습니다. 우리는 검색 매개 변수를 최적화 하 고 이어질 약 25 µ m의 최소 기능 크기 9.5 µ m의 복 치수를 활용. 이 해결책은 세계적으로 그리고 정확 하 게, CCM 병 변 볼륨 및 수를 측정 하 여 마우스 두뇌 병 변 CCM의 높은-품질 3 차원 매핑을 제공 충분 합니다. 이 메서드는 CCM 및 기타 뇌혈관 질환에 대 한 분자 및 잠재적인 치료 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.
Introduction
CCM는 얇은 벽으로, 뇌의 혈관 기형 인간의 인구1에서 최대 0.5%의 보급으로 크기. CCM 3 개의 유전자 중 하나에 손실의 기능 돌연변이 때문에 지배적인 무질서로 상속 될 수 있습니다: CCM1 (일명 Krit1), CCM2및 CCM3 ( PDCD10라고도 함)2,3,4 ,,56. 이 유전자는 복잡 한 신호에 존재 하는.
CCM7,8,,910에 대 한 책임은 CCM 유전자의 다운스트림 경로 이해 하 고 모델 인간의 CCM 질병에 다양 한 모델 개발 되었습니다. 가장 강력한 모델 조건부로 신생아 강아지8,10p 1에서 tamoxifen을 유도할 수 있는 Cdh5 CreERT2 와 함께 Ccm 유전자 중 하나를 삭제 하는 것입니다. 이 새끼는 이후 P6에서 뇌 병 변 CCM을 개발 하 고 검색 메커니즘에 대 한 전 임상 연구 및 치료제 CCM 질병 치료에 대 한 이상적인 모델이 될 것으로 예상 된다.
쥐의 뇌에서 CCM 병 변 부담 조직학 기반 방법, 매우 시간이 걸리는 하는 방식으로 주로 측정 되었다 하 고 조사에 따라 바이어스10,,1112. MRI 기반 방법 성인 마우스 모델9,13CCM 병 변 부담을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나, 고도로 전문화 된 작은 동물 MRI 계기와 하룻밤 몇 시간의 긴 검색 시간 CCM 병 변 식별에 만족 스러운 해결책을 달성 하기 위해 필요 합니다. 또한, 여부 MRI 신생아 쥐에 있는 CCM 장애 감지를 사용할 수 있는 보고 하지 않은 고 해상도 감도 제한할 수 있습니다.
우리는 최근 이미지 CCM 병 변14,15를 분석 하는 마이크로-CT 기술 개발. 이 고해상도, 시간 및 비용 효율적인 방법을 극적으로 증가 기계 및 치료 연구에 CCM 질병 모델의 값. 대비 향상, 전체 마운트 착 방법 부드러운 조직 및 마우스 배아16,17의 마이크로-CT 영상에 대 한 사용 되었습니다. 이전에 우리는 오스뮴 기반 얼룩을 사용 뇌14병 변 CCM의 마이크로-CT 영상에 대 한 대비 향상. 이 문서에서 우리는 더 적은 독성, 비-파괴적인, 사용 하 고 비용 효율적인 시는 요오드 기반 Lugol의 솔루션, 마이크로-CT 영상에 대 한 대비를 강화 하. 요오드 두뇌에 걸쳐 확산 수 있으며 혈18에 대 한 높은 선호도 있습니다.
자세한 프로토콜은 여기는 이미징 함께 신생아 마우스 모델에서 CCM 변의 유도 및 발표 대비 기반 마이크로 중부와 CCM 장애의 분석 이 마이크로-CT 기반된 메서드 CCM 병 변 양의 양적 글로벌 측정, 수와 쥐의 뇌 병 변 CCM의 3 차원 위치를 정확 하 게 식별 하며 비용을 크게 줄일 수와 시간 표현 형이이 동물 있어야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CCM은 개인1의 0.5%까지 영향을 미치는 일반적인 혈관 기형입니다. CCM 산발적 또는 가족 형태로 발생할 수 있습니다. 환자 예 후 명확 하지 않습니다 종종 CCM 병 변 원인 뇌졸중 및 기타 신경학 상 결과 예기치 않게 파열 수로. 현재 유일한 치료 옵션은 높은 위험을 동반 하는 병 변 수술로 제거 하는.
인간의 CCM 조건에 재현 되어 최근 동물 모델7</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 인정 시설 및 현미경 검사 법 및 시드니의 대학에 Microanalysis (ACMM)에 대 한 시드니 현미경 및 Microanalysis 연구 시설 (AMMRF)와 호주 중심의 과학 및 기술 지원. 이러한 연구는 호주 국민 건강에 의해 지원 되었다 고 의료 연구 위원회 (NHMRC) 프로젝트는 161558 및 APP1124011 (XZ)를 부여 합니다.
Materials
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
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