Summary

प्रेरण और माइक्रो-सीटी माउस मॉडल में सेरेब्रल गुफात्मक विकृतियों की इमेजिंग

Published: September 04, 2017
doi:

Summary

इस प्रोटोकॉल एक माउस मॉडल में मस्तिष्क की गुफात्मक कुरूपता रोग की प्रेरण दर्शाता है और इसके विपरीत का उपयोग करता है बढ़ाया माइक्रो गणना टोमोग्राफी घाव बोझ को मापने के लिए । इस विधि की स्थापना की माउस मॉडल के मूल्य को बढ़ाता है आणविक आधार और मस्तिष्कीय गुफा कुरूपता और अंय मस्तिष्कवाहिकीय रोगों के लिए संभावित उपचार का अध्ययन ।

Abstract

CCM1 (उर्फ KRIT1), CCM2, या CCM3 (उर्फ PDCD10) जीन में उत्परिवर्तनों मानव में मस्तिष्क की गुफात्मक कुरूपता (सीसीएम) के कारण । प्रसव पशुओं में सीसीएम जीन के tamoxifen प्रेरित विलोपन द्वारा सीसीएम रोग के माउस मॉडलों की स्थापना की गई है । इन माउस मॉडलों को आणविक तंत्र और सीसीएम रोग के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण की जांच करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं । घाव के बोझ और प्रगति का आकलन करने के लिए एक सटीक और मात्रात्मक विधि इन पशु मॉडलों के पूर्ण मूल्य का दोहन करने के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक माउस मॉडल में सीसीएम रोग की प्रेरण प्रदर्शन और इसके विपरीत का उपयोग बढ़ाया एक्स-रे माइक्रो गणना टोमोग्राफी (माइक्रो सीटी) विधि माउस दिमाग में सीसीएम घाव बोझ को मापने के लिए । प्रसव day 1 (P1) पर हमने 4-hydroxytamoxifen (4HT) को recombinase-Cdh5 CreErt2 के transgene floxed से सट कर Cre एलील गतिविधि को एक्टिवेट करने के लिए इस्तेमाल किया । माउस दिमाग में सीसीएम घावों P8 पर विश्लेषण किया गया । माइक्रो सीटी, आयोडीन आधारित Lugol के समाधान के लिए मस्तिष्क के ऊतकों में इसके विपरीत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हम स्कैन मापदंडों अनुकूलित किया है और ९.५ µm, जो लगभग 25 µm के एक न्यूनतम सुविधा आकार के लिए नेतृत्व के एक voxel आयाम का उपयोग. इस संकल्प को सीसीएम घावों की मात्रा और दुनिया भर में और सही संख्या को मापने के लिए पर्याप्त है, और माउस दिमाग में सीसीएम घावों की उच्च गुणवत्ता वाले 3-डी मानचित्रण प्रदान करते हैं । यह विधि सीसीएम और अन्य मस्तिष्कवाहिकीय रोगों के लिए आणविक आधार और संभावित उपचारों का अध्ययन करने के लिए स्थापित माउस मॉडलों के मूल्य को बढ़ाता है ।

Introduction

सीसीएम पतली दीवारों, मानव आबादी1में ०.५% तक की व्यापकता के साथ मस्तिष्क में फैली हुई संवहनी विकृतियों रहे हैं । सीसीएम एक प्रमुख तीन जीन में से एक में समारोह उत्परिवर्तनों के नुकसान के कारण विकार के रूप में विरासत में मिला जा सकता है: CCM1 (उर्फ Krit1), CCM2, और CCM3 (जिसे PDCD10भी कहा जाता है)2,3,4 ,5,6. ये जीन एक सिंगल सिग्नलिंग कॉम्प्लेक्स में मौजूद हैं ।

विभिन्न मॉडलों को मॉडल मानव सीसीएम रोग के लिए विकसित किया गया है और सीसीएम जीन के बहाव मार्ग को समझने के लिए कि सीसीएम7,8,9,10के लिए जिम्मेदार हैं. सबसे मजबूत मॉडल सशर्त सीसीएम जीन में से किसी एक tamoxifen-inducible Cdh5-CreERT2 P1 पर नवजात पिल्ले8,10में से किसी एक को नष्ट करने के लिए है । इन पिल्ले P6 आगे से मस्तिष्क में सीसीएम घावों का विकास और सीसीएम रोगों के इलाज में तंत्र और चिकित्सकीय एजेंटों के लिए खोज में पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल होने की उम्मीद कर रहे हैं.

माउस मस्तिष्क में सीसीएम घाव बोझ मुख्य रूप से प्रोटोकॉल आधारित तरीकों से मापा गया है, एक दृष्टिकोण है कि बहुत समय लेने वाली है और जांचकर्ता पूर्वाग्रह के अधीन10,11,12। एमआरआई आधारित तरीकों वयस्क माउस मॉडल9,13में सीसीएम घावों के बोझ का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, एक अति विशिष्ट छोटे जानवर एमआरआई साधन और लंबे समय तक स्कैन-रात के लिए कई घंटे की अवधि के लिए सीसीएम घावों की पहचान करने के लिए एक संतोषजनक समाधान प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, क्या एमआरआई नवजात चूहों में सीसीएम घावों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सूचित नहीं किया गया है और संकल्प संवेदनशीलता सीमा हो सकती है ।

हम हाल ही में छवि के लिए एक माइक्रो सीटी तकनीक विकसित की है और सीसीएम घावों14,15का विश्लेषण । इस उच्च संकल्प, समय और लागत प्रभावी विधि नाटकीय रूप से यंत्रवत और चिकित्सीय अध्ययन में सीसीएम रोग मॉडल के मूल्य को बढ़ावा । इसके विपरीत बढ़ाने, पूरे माउंट धुंधला तरीके सूक्ष्म ऊतकों और माउस भ्रूण16,17के माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है । इससे पहले, हमने मस्तिष्क में सीसीएम घावों की माइक्रो-सीटी इमेजिंग के लिए कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए एक आज़मियम आधारित दाग का इस्तेमाल किया है14. इस पत्र में, हम एक कम विषाक्त, गैर विनाशकारी, और लागत कुशल एजेंट, एक आयोडीन आधारित है Lugol समाधान का इस्तेमाल किया, माइक्रो सीटी इमेजिंग के लिए इसके विपरीत बढ़ाने के लिए । आयोडीन मस्तिष्क भर में फैलाना और18रक्त के लिए एक उच्च समानता कर सकते हैं ।

विस्तृत प्रोटोकॉल एक विपरीत आधारित माइक्रो-सीटी के साथ सीसीएम घावों के इमेजिंग और विश्लेषण के साथ साथ एक नवजात माउस मॉडल में सीसीएम घावों की प्रेरण के लिए यहाँ प्रस्तुत किया गया है । इस माइक्रो-सीटी आधारित विधि सीसीएम घावों की मात्रा की मात्रात्मक वैश्विक माप प्रदान करता है, सही संख्या और माउस मस्तिष्क में सीसीएम घावों के 3-डी स्थान की पहचान, और बहुत लागत और इन जानवरों को phenotype करने के लिए आवश्यक समय कम कर देता है ।

Protocol

सभी पशु नैतिकता और प्रोटोकॉल को सिडनी स्थानीय स्वास्थ्य जिला पशु कल्याण समिति और तिआनजिन चिकित्सा विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी प्रयोगो?…

Representative Results

P1 पर 4HT का एक इंजेक्शन सेरिबैलम में सीसीएम घावों को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था । Lugol आयोडीन के विपरीत माइक्रो सीटी पर्याप्त सीसीएम घावों का पता लगाया है और इसकी मात्रा और संख्या को बढ़ात?…

Discussion

सीसीएम एक आम संवहनी कुरूपता है कि अप करने के लिए प्रभावित करता है ०.५% व्यक्तियों की1। सीसीएम छिटपुट या पारिवारिक रूप में हो सकता है । रोगी रोग का निदान अक्सर स्पष्ट नहीं है के रूप में सीसीएम घाव?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों की सुविधाओं और सिडनी माइक्रोस्कोपी एंड Microanalysis रिसर्च फैसिलिटी (AMMRF) और सिडनी विश्वविद्यालय में ऑस्ट्रेलियन सेंटर फॉर माइक्रोस्कोपी एंड Microanalysis (ACMM) की वैज्ञानिक और तकनीकी सहायता स्वीकार करते हैं । ये अध्ययन ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) परियोजना अनुदान १६१५५८ और APP1124011 (XZ) द्वारा समर्थित थे.

Materials

4-hydroxy tamoxifen Sigma-Aldrich H6278 To activate Cdh5-CreErt2
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML To dilute 4-hydroxy tamoxifen
Stereomicroscope Leica M205FA To take macroscopic images
Lugol's Iodine solution Sigma-Aldrich L6146 To stain samples for contrast micro-CT
Plastic paraffin film Parafilm PM992 To package samples
Micro-CT Xradia MicroXCT-400 Micro-CT
3D rendering software FEI Visualization Science group Avizo 3D image processing software To analyse micro-CT scans

References

  1. Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
  2. Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
  3. Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
  4. Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
  5. Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
  6. Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
  7. McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
  8. Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
  9. Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
  10. Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
  11. McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
  12. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  13. Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
  14. Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
  15. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
  18. Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
  19. Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
check_url/56476?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Choi, J. P., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model. J. Vis. Exp. (127), e56476, doi:10.3791/56476 (2017).

View Video