Insugnings- och Micro-CT-avbildning av Cerebral Cavernous missbildningar i musmodell
Summary
Detta protokoll visar induktion av cerebral cavernous missbildningar sjukdom i en musmodell och använder kontrastmedelsförstärkt micro datortomografi för att mäta lesion börda. Metoden förbättrar värdet av etablerade musmodeller att studera den molekylära basen och potentiella behandlingar för cerebral cavernous missbildningar och andra cerebrovaskulära sjukdomar.
Abstract
Mutationer i den CCM1 (aka KRIT1), CCM2, eller CCM3 (aka PDCD10) gen orsaka cerebral ihålig missbildning (CCM) hos människor. Mus-modeller av CCM sjukdom har fastställts av tamoxifen inducerad radering av Ccm gener i postnatal djur. Dessa musmodeller ger ovärderliga verktyg för att undersöka molekylära mekanismer och terapeutiska metoder för CCM sjukdom. En korrekt och kvantitativ metod för att bedöma lesion börda och progression är viktigt att utnyttja det fulla värdet av dessa djurmodeller. Här, vi demonstrera induktion av CCM sjukdom i en musmodell och användningen av kontrasten förbättrad röntgen micro datortomografi (mikro-CT) metod för att mäta CCM lesion börda i mus hjärnor. Vid postnatal dag 1 (P1) använde vi 4-hydroxytamoxifen (4HT) för att aktivera Cre recombinase aktivitet från den Cdh5-CreErt2 transgenens klyva den floxed allelen av Ccm2. CCM lesioner i mus hjärnor analyserades på P8. För mikro-CT användes jod baserade Lugols lösning för att förbättra kontrast i hjärnvävnad. Vi har optimerat parametrarna av och utnyttjade en voxel dimension av 9,5 µm, som leder till en minsta storleken cirka 25 µm. Denna resolution är tillräcklig för att mäta CCM lesion volym och antal globalt och exakt och ger hög kvalitet 3D-kartläggning av CCM lesioner i mus hjärnor. Metoden förbättrar värdet av de etablerade musmodeller att studera den molekylära basen och potentiella behandlingar för CCM och andra cerebrovaskulära sjukdomar.
Introduction
CCM är tunna väggar, vidgade vaskulära missbildningar i hjärnan med förekomst av upp till 0,5% i den mänskliga befolkning1. CCM kan ärvas som en dominerande störning på grund av förlust-av-funktion mutationer i någon av tre gener: CCM1 (aka Krit1), CCM2och CCM3 (även kallad PDCD10)2,3,4 ,5,6. Dessa gener är närvarande i en enda signalering komplexa.
Olika modeller har utvecklats att modellen mänskliga CCM sjukdom och att förstå de nedströms vägarna i CCM gener som ansvarar för CCM7,8,9,10. Den mest robusta modellen är villkorligt bort någon av generna som Ccm med tamoxifen-inducerbara Cdh5-CreERT2 på P1 i nyfödda valpar8,10. Dessa ungar utveckla CCM lesioner i hjärnan från P6 framåt och förväntas vara en idealmodell för prekliniska studier i sökandet efter mekanismer och terapeutiska medel vid behandling av CCM sjukdomar.
CCM lesion börda i mus hjärna har mätts främst av histologi-baserade metoder, en strategi som är extremt tidskrävande och omfattas av prövaren bias10,11,12. MRI baserade metoder har använts för att bedöma CCM lesion bördan i vuxen mus modell9,13. Dock krävs ett högspecialiserade små djur MRI instrument och scan-länge flera timmar till över natten att uppnå en tillfredsställande lösning att identifiera CCM lesioner. Även om MRI kan användas för att upptäcka CCM lesioner hos neonatala möss har inte rapporterats och upplösning kan begränsa känslighet.
Vi har nyligen utvecklat en mikro-CT teknik för att bild och analysera CCM lesion14,15. Denna högupplösta, tids- och kostnadseffektiv metod du dramatiskt ökat värdet av CCM sjukdom modell i mekanistiska och terapeutiska studier. Kontrast-öka, hela mount färgning metoder har använts för mikro-CT-avbildning av mjuka vävnader och mus embryon16,17. Vi har tidigare använt en osmium-baserade färgning för att förbättra kontrast för mikro-CT-avbildning av CCM lesioner i hjärnan14. I detta papper, vi använde en mindre giftig, icke-förstörande, och kostnadseffektiva reagens, en jod baserade Lugols lösning, för att förbättra kontrast för mikro-CT bilddiagnostik. Jod kan sprida i hela hjärnan och har en hög affinitet för blod18.
Det detaljerade protokollet presenteras här för induktion av CCM lesioner i en neonatal musmodell tillsammans med bildtagning och analys av CCM lesioner med en kontrast-baserade micro-CT. Denna mikro-CT metod ger kvantitativ global mätning av CCM lesion volym, korrekt identifierar antalet och 3D-läge av CCM lesioner i hjärnan mus och kraftigt reducerar kostnaden och tid som krävs att fenotyp dessa djur.
Protocol
Representative Results
Discussion
CCM är en gemensam vaskulära missbildningar som drabbar upp till 0,5% av individer1. CCM kan uppstå i sporadiska eller familjär form. Patientens prognos är ofta oklart eftersom CCM lesioner kan brista oväntat för att orsaka stroke och andra neurologiska konsekvenserna. För närvarande är det enda behandlingsalternativ att kirurgiskt avlägsna lesioner, som åtföljs av hög risk.
Mänskliga CCM villkor har nyligen reproducerats i djur modeller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner faciliteter samt vetenskaplig och teknisk hjälp av Sydney microscopyen & mikroanalys Research Facility (AMMRF) och australiska centrum för mikroskopi och mikroanalys (ACMM) vid University of Sydney. Dessa studier stöddes av Australian National Health och medicinsk forskning rådet (NHMRC) projektanslag 161558 och APP1124011 (XZ).
Materials
| 4-hydroxy tamoxifen | Sigma-Aldrich | H6278 | To activate Cdh5-CreErt2 |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | To dilute 4-hydroxy tamoxifen |
| Stereomicroscope | Leica | M205FA | To take macroscopic images |
| Lugol's Iodine solution | Sigma-Aldrich | L6146 | To stain samples for contrast micro-CT |
| Plastic paraffin film | Parafilm | PM992 | To package samples |
| Micro-CT | Xradia | MicroXCT-400 | Micro-CT |
| 3D rendering software | FEI Visualization Science group | Avizo 3D image processing software | To analyse micro-CT scans |
References
- Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
- Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
- Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
- Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
- Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
- Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
- McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
- Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
- Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
- Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
- McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
- Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
- Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
- Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
- Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).
