Ballon-baserede skade til at fremkalde Myointimal hyperplasi i mus Abdominal Aorta
Summary
Denne artikel viser en murine model for at studere udviklingen af myointimal hyperplasi (MH) efter aorta ballon skade.
Abstract
Anvendelsen af dyremodeller er afgørende for en bedre forståelse af MH, en væsentlig årsag til arteriel stenose. I denne artikel viser vi en murine ballon denudation model, der kan sammenlignes med etablerede fartøj skade modeller i store dyr. Aorta denudation model med ballon katetre efterligner de kliniske omgivelser og fører til sammenlignelige pathobiological og fysiologiske ændringer. Kort, efter at have udført et vandret snit i aorta abdominalis, en ballonkateter vil være indsat i fartøjet, oppustet og indført retrogradely. Oppustning af ballonen vil føre til intima skade og overdistension af fartøjet. Efter fjernelse af kateteret, vil aorta indsnit blive lukket med enkelt masker. Modellen i denne artikel er reproducerbare, nem at udføre og kan etableres hurtigt og pålideligt. Det er specielt velegnet til at vurdere dyre eksperimentelle terapeutiske agenter, der kan anvendes på en økonomisk måde. Ved hjælp af forskellige knockout-mus stammer, kan virkningerne af forskellige gener på MH udvikling vurderes.
Introduction
Arteriel stenose i koronar og perifere arterier har en stor effekt på sygelighed og dødelighed af patienter1. En underliggende patologiske mekanisme er myointima hyperplasi (MH), som er karakteriseret ved øget spredning, migration og syntese af ekstracellulære matrix proteiner fra vaskulære glatte muskelceller celler (SMC)2. SMC er beliggende i media lag af fartøjet og overfører ved stimulation til overfladen af lumen. Stimulerende signaler inkluderer vækstfaktorer cytokiner, celle-celle kontakt, lipider, ekstracellulære matrix komponenter og mekaniske shear og strække styrker3,4,5,6. Skader af karvæggen, patologiske eller iatrogen, forårsage endotel celle og glatte muskulatur celleskader og stimulere inflammatoriske reaktioner, og således føre til MH7.
Forskellige dyremodeller er i øjeblikket tilgængelig at studere arteriel skade og myointima hyperplasi. Store dyr som grise eller hunde har fordelen, at sharing en lignende arterie og koronar anatomi med mennesker og er specielt velegnet til studier undersøger angioplastik teknikker, procedure og enheder8. Gris modeller har dog Ulempen ved højere thrombogenicity9,10, mens hunde kun har en mild reaktion fartøj skade11. Desuden, kræver alle store dyremodeller særlige boliger, udstyr og personale, som er forbundet med høje omkostninger og er ikke altid tilgængelige på en institution. Lille dyremodeller omfatter rotter og mus. Sammenlignet med rotter, har mus fordelene ved lavere omkostninger og eksistensen af en bred vifte af knock ud modeller. Den model, der er beskrevet i denne video kan kombineres med ApoE-/-mus fodret med en vestlig kost at nøje efterligne de kliniske omgivelser for ballonudvidelse i aterosklerotisk fartøjer12. Tidligere modeller induceret vaskulære skade via wire skade13, flydende udtørring14, foråret15eller manchet skade16. Da arten af skaden vil høj grad påvirke udviklingen og forfatning af MH, er ved hjælp af en ballonkateter for at fremkalde fartøj skade den bedste måde at efterligne de kliniske omgivelser.
I denne artikel beskriver vi en ny metode for at fremkalde MH med en ballonkateter i mus. Brug af et ballonkateter (1,2 mm x 6 mm) med en RX-Port (figur 1A) tillader skrabning af det intima lag og samtidig induktion af en overdistension af fartøjet. Begge disse faktorer er vigtige udløsere for udviklingen af MH. Observationstidspunkt for denne model er 28 dage17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikel viser en murine model for at studere udviklingen af myointimal hyperplasi og giver mulighed for udforskning af de underliggende patologiske processer og afprøvning af nye lægemidler eller terapeutiske muligheder.
Det mest afgørende skridt i denne protokol er denudation af aorta. Særlig omsorg bør lægges under dette trin, da overdreven denudation vil føre til aneurisme dannelse og model fiasko. På den anden side, hvis denudation udføres tilstrækkeligt, vil for lidt myoin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Christiane Pahrmann for hendes teknisk bistand.
DW blev støttet af Max Kade Foundation. T.D. modtaget tilskud fra andet Kröner Fondation (2012_EKES.04) og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. modtaget forskningslegater fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
Materials
| 10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
| 3 mL Syringe | BD Medical | 309658 | |
| 37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
| Antigen retrieval solution | Dako | S1699 | |
| Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| C57BL/6J | Charles River | Stock number 000664 | |
| Clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| Collagen 3 | abcam | ab7778 | Antibody |
| DAPI | Thermo Fischer | D1306 | |
| Donkey anti-Goat IgG AF555 | Invitrogen | A21432 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A21206 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A11055 | Secondary antibody |
| Donkey anti-Rabbit IgG AF555 | Invitrogen | A31572 | Secondary antibody |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
| Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
| FAP | abcam | ab28246 | Antibody |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| Heparin | Rotexmedica | PZN 3862340 | 25.000 I.E./mL |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| Image-iT FX Signal Enhancer | Invitrogen | I36933 | Blocking solution |
| Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
| Microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine – 4mm |
| MINI TREK Coronary Dilatation Catheter 1.20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange | Abbott | 1012268-06U | |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
| NaCl 0,9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
| Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
| PBS pH 7,4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | |
| Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
| Primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Prolong Gold Mounting solution | Thermo Fischer | P36930 | Mounting solution for immunofluorescence stained slides |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Resorcin-Fuchsin Weigert | Waldeck | 2E-30 | Trichrome staining |
| Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Scissors Vannas-style | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
| Fast acting Adhesive MINIS 3x1g | UHU | 45370 | Cyanoacrylate |
| Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
| SM22 | abcam | ab10135 | Antibody |
| SMA | abcam | ab21027 | Antibody |
| Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Tabotamp fibrillar | Ethicon | 431962 | Absorbable hemostat |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| U-100 Insulin syringe | BD Medical | 324825 | |
| Vessel Dilator | Fine Science Tools | 18603-14 | |
| Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
| Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
| Xylene | Th. Geyer | 3410 |
References
- Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., Minino, A. M., Kung, H. C. Deaths: final data for 2009. Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-116 (2011).
- Austin, G. E., Ratliff, N. B., Hollman, J., Tabei, S., Phillips, D. F. Intimal proliferation of smooth muscle cells as an explanation for recurrent coronary artery stenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 6 (2), 369-375 (1985).
- Greenwald, S. E., Berry, C. L. Improving vascular grafts: the importance of mechanical and haemodynamic properties. J Pathol. 190 (3), 292-299 (2000).
- Majesky, M. W., Schwartz, S. M. Smooth muscle diversity in arterial wound repair. Toxicol Pathol. 18 (4 Pt 1), 554-559 (1990).
- Owens, G. K. Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells. Physiol Rev. 75 (3), 487-517 (1995).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Kleemann, R., Zadelaar, S., Kooistra, T. Cytokines and atherosclerosis: a comprehensive review of studies in mice. Cardiovasc Res. 79 (3), 360-376 (2008).
- Karas, S. P., et al. Coronary intimal proliferation after balloon injury and stenting in swine: an animal model of restenosis. J Am Coll Cardiol. 20 (2), 467-474 (1992).
- Ip, J. H., et al. The role of platelets, thrombin and hyperplasia in restenosis after coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 17 (6 Suppl B), 77B-88B (1991).
- Mason, R. G., Read, M. S. Some species differences in fibrinolysis and blood coagulation. J Biomed Mater Res. 5 (1), 121-128 (1971).
- Lafont, A., Faxon, D. Why do animal models of post-angioplasty restenosis sometimes poorly predict the outcome of clinical trials?. Cardiovasc Res. 39 (1), 50-59 (1998).
- Matter, C. M., et al. Increased balloon-induced inflammation, proliferation, and neointima formation in apolipoprotein E (ApoE) knockout mice. Stroke. 37 (10), 2625-2632 (2006).
- Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. Mouse model of arterial injury. Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).
- Simon, D. I., et al. Decreased neointimal formation in Mac-1(-/-) mice reveals a role for inflammation in vascular repair after angioplasty. J Clin Invest. 105 (3), 293-300 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Moroi, M., et al. Interaction of genetic deficiency of endothelial nitric oxide, gender, and pregnancy in vascular response to injury in mice. J Clin Invest. 101 (6), 1225-1232 (1998).
- Painter, T. A. Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors. Artif Organs. 15 (2), 103-118 (1991).
- Stubbendorff, M., et al. Inducing myointimal hyperplasia versus atherosclerosis in mice: an introduction of two valid models. J Vis Exp. (87), e51459 (2014).
- Deuse, T., et al. Dichloroacetate prevents restenosis in preclinical animal models of vessel injury. Nature. 509 (7502), 641-644 (2014).
