Serum og Plasma kopi nummer påvisning ved hjælp af Real-time PCR
Summary
Dette manuskript beskriver kopi nummer variation analyse udført i serum eller plasma DNA ved hjælp af real-time PCR tilgang. Denne metode er velegnet til forudsigelse af resistens i kastration resistente prostata cancerpatienter, men det kunne være informativ også for andre sygdomme.
Abstract
Serum og plasma celle gratis DNA (cfDNA) har vist sig som en informativ, ikke-invasive biomarkører for kræftdiagnose, prognose, overvågning og forudsigelse af behandling modstand. Med udgangspunkt i den hypotese, at androgen receptor (AR) gen kopi nummer (KN) vinde er en hyppig begivenhed i metastatisk kastration modstand prostatakræft (mCRPC), foreslår vi, at analysere denne begivenhed i cfDNA som en potentiel prædiktive biomarkør.
Vi vurderede AR CN i cfDNA ved hjælp af 2 forskellige real-time PCR assays og 2 reference gener (RNaseP og siden1). DNA beløb af 60 ng blev brugt til hvert assay kombination. AR KN-gevinst blev bekræftet ved hjælp af Digital PCR som en mere præcis metode. KN-variation analyse har allerede påvist for at være informativ for forudsigelse af behandling modstand i fastsættelsen af mCRPC, men det kunne også være nyttigt til andre formål i forskellige patient indstillinger. KN-analyse på cfDNA har flere fordele: det er non-invasiv, hurtig og nem at udføre, og det starter fra en lille mængde af serum eller plasma materiale.
Introduction
Cirkulerende celle gratis DNA (cfDNA) i blodet har vist sig for at være en optimal kilde til biomarkører for kræftdiagnose, prognose, overvågning og forudsigelse af behandling modstand1,2. Mange undersøgelser har vist en god overensstemmelse mellem DNA ændringer (mutationer, kopi nummer variationer, epigenetiske ændringer i væv) og dem, der findes i tilsvarende plasma prøver1, bekræfter, at cirkulerende tumor DNA (ctDNA) er informativ for primær og metastatisk tumor væv ændringer3. Muligheden for at studere ctDNA giver således mulighed for genopbygningen af genomisk rearrangementer og kopi nummer variationer (CNVs) på specifikke onkogener4, at identificere potentielt metastatisk klonede og subclonal celler. CtDNA har vist sig at være klinisk nyttigt især for kræft behandling overvågning som det havne specifikke mutationer og CNVs, relateret til specifikke målrettede behandlinger5,6. Det også overvinder behovet for væv biopsier og giver resultater, der opnås på forskellige tidspunkter i løbet af en bestemt kræftbehandling i en ikke-invasiv måde.
For så vidt angår prostatakræft, en betydelig korrelation mellem cirkulerende celler-fri androgen receptor (AR) CNVs og behandling svar på abiraterone og enzalutamide har været vist, der angiver AR genet kopi nummer (CN) i cfDNA kan være en lovende biomarkør i stand til at forudsige behandling modstand7,8,9,10,11. CNVs af specifikke gener i ctDNA kan evalueres ved hjælp af forskellige metoder med forskellige følsomhed, omkostninger og hurtighed (fx. real-time, Digital PCR, og næste Generation Sequencing).
Her beskriver vi en enkel og hurtig tilgang, baseret på dupleks assays i real-time PCR teknologi, for at vurdere AR CN i cfDNA fra serum og plasma prøver7,8. Vi fandt to forskellige PCR assays designet på to forskellige genomisk regioner i intron 5 af AR (Xq12) og to andre gener, som intern standard reference gener kendt for at have en normal kopi nummer status i prostata cancer (RNaseP, beliggende på 14q11; Siden1, beliggende på 1 p 34). Vi har valgt to reference gener, snarere end en, at øge præcision og følsomhed af resultaterne. En DNA beløb af 60 ng blev forstærket for hvert assay kombination (kombinerede assay for AR-assay_1 + RNaseP og AR-assay_2 + AGO1). Tre serum eller plasma DNA-prøver fra raske mænd blev samlet og brugt som en kalibrator. Vi anså cutoffs af > 1,5 for AR vinding og < 0,5 til sletning. En af de vigtigste fordele ved denne metode er at den er fleksibel og at andre gener kan også vurderes, ændre standard intern reference gener, på grundlag af tumor type og karakteristik.
Protocol
Representative Results
Discussion
AR KN-analyse i serum og plasma stikprøven repræsenterer en ny, ikke-invasiv metode for stratificering af kastration resistente prostatakræft (CRPC) patienter. Det har været for nylig påvist, at AR KN er i stand til at forudsige resultater i CRPC patienter behandlet med abiraterone og enzalutamide, før og efter kemoterapi7,8,9,10.
Den største…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Chiara Molinari og Filippo Martignano for støtte i dataanalyse.
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
