सीरम और प्लाज्मा कॉपी नंबर का पता लगाने रीयल टाइम पीसीआर का उपयोग
Summary
इस पांडुलिपि की नकल संख्या भिंनता सीरम या प्लाज्मा वास्तविक समय पीसीआर दृष्टिकोण का उपयोग कर डीएनए में प्रदर्शन विश्लेषण का वर्णन है । इस विधि बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर रोगियों में दवा प्रतिरोध की भविष्यवाणी के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह भी अंय बीमारियों के लिए जानकारीपूर्ण जा सकता है ।
Abstract
सीरम और प्लाज्मा सेल नि: शुल्क डीएनए (cfDNA) एक जानकारीपूर्ण, कैंसर निदान, रोग का निदान, निगरानी, और उपचार प्रतिरोध की भविष्यवाणी के लिए गैर इनवेसिव मार्क्स के स्रोत के रूप में दिखाया गया है । इस परिकल्पना से शुरू कि एण्ड्रोजन रिसेप्टर (AR) जीन प्रति संख्या (CN) लाभ मेटास्टेटिक बधिया प्रतिरोध प्रोस्टेट कैंसर (mCRPC) में एक लगातार घटना है, हम एक संभावित पूर्वानुमान के रूप में cfDNA में इस घटना का विश्लेषण करने का प्रस्ताव है ।
हम 2 अलग वास्तविक समय पीसीआर परख और 2 संदर्भ जीन (RNaseP और पहले1) का उपयोग कर cfDNA में एआर CN मूल्यांकन किया । ६० एनजी की डीएनए राशि प्रत्येक परख संयोजन के लिए इस्तेमाल किया गया था । AR CN लाभ एक अधिक सटीक विधि के रूप में डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर पुष्टि की गई थी । CN भिन्नता विश्लेषण पहले से ही mCRPC की सेटिंग में उपचार प्रतिरोध की भविष्यवाणी के लिए जानकारीपूर्ण किया जा करने के लिए प्रदर्शित किया गया है, लेकिन यह भी विभिन्न रोगी सेटिंग्स में अन्य प्रयोजनों के लिए उपयोगी हो सकता है. cfDNA पर CN विश्लेषण कई फायदे हैं: यह गैर इनवेसिव, तेजी से और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और यह सीरम या प्लाज्मा सामग्री की एक छोटी मात्रा से शुरू होता है ।
Introduction
सेल मुक्त डीएनए (रक्त में cfDNA) परिसंचारी कैंसर निदान, रोग का निदान, निगरानी के लिए एक इष्टतम स्रोत का प्रदर्शन किया गया है, और उपचार के प्रतिरोध की भविष्यवाणी1,2। कई अध्ययनों से पता चला है डीएनए परिवर्तन के बीच एक अच्छा सामंजस्य (उत्परिवर्तनों, कॉपी संख्या रूपांतरों, epigenetic संशोधनों) ऊतकों में और उन इसी प्लाज्मा नमूनों में पाया1, पुष्टि की है कि परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (ctDNA) है प्राथमिक और मेटास्टेटिक ट्यूमर ऊतक परिवर्तन3के लिए जानकारीपूर्ण । ctDNA का अध्ययन करने की संभावना इस प्रकार जीनोमिक पुनर्व्यवस्थाओं के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है और विशिष्ट oncogenes4पर प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों (CNVs), संभावित मेटास्टेटिक क्लोनिंग और उपक्लोनिंग कोशिकाओं की पहचान. CtDNA को नैदानिक रूप से उपयोगी कैंसर के इलाज के लिए निगरानी के रूप में यह विशिष्ट उत्परिवर्तनों और CNVs, विशिष्ट लक्षित उपचारों से संबंधित5,6बंदरगाह दिखाया गया है । यह भी ऊतक बायोप्सी के लिए की जरूरत पर काबू पा और परिणाम एक गैर इनवेसिव तरीके से एक विशिष्ट कैंसर के इलाज के दौरान अलग समय पर प्राप्त किया जा करने के लिए अनुमति देता है ।
प्रोस्टेट कैंसर के संबंध में, परिसंचारी सेल के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध मुक्त एण्ड्रोजन रिसेप्टर (AR) CNVs और abiraterone और enzalutamide के लिए उपचार प्रतिक्रिया दिखाया गया है, एआर जीन की प्रतिलिपि संख्या (CN) cfDNA में संकेत हो सकता है एक होनहार उपचार प्रतिरोध7,8,9,10,11की भविष्यवाणी करने में सक्षम मार्कर । ctDNA में विशिष्ट जीन के CNVs अलग संवेदनशीलता, लागत, और तेजी के साथ अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है (उदावास्तविक समय, डिजिटल पीसीआर, और अगली पीढ़ी अनुक्रमण) ।
यहां हम वास्तविक समय पीसीआर प्रौद्योगिकी में द्वैध परख के आधार पर एक सरल और तेजी से दृष्टिकोण का वर्णन, एआर CN से cfDNA में सीरम और प्लाज्मा नमूनों7,8के मूल्यांकन के लिए । हम दो अलग पीसीआर एआर (Xq12) और दो अंय जीन के 5 intron के भीतर दो अलग जीनोमिक क्षेत्रों पर डिजाइन पर विचार किया, आंतरिक मानक संदर्भ जीन के रूप में जाना जाता है प्रोस्टेट कैंसर में एक सामांय प्रतिलिपि संख्या स्थिति (RNaseP, 14q11 पर स्थित है; पहले1, 1p34 पर स्थित) । हम दो संदर्भ जीन का चयन किया, बल्कि एक से, परिशुद्धता और परिणामों की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए । ६० एनजी के एक डीएनए राशि प्रत्येक परख संयोजन के लिए प्रवर्धित किया गया था ( ar-assay_1 + RNaseP के लिए और ar-assay_2 + AGO1के लिए संयुक्त परख) । स्वस्थ पुरुषों से तीन सीरम या प्लाज्मा डीएनए नमूने परित और एक औजार के रूप में इस्तेमाल किया गया । हमने माना की कटऑफ & #62; १.५ के लिए AR गेन और & #60; ०.५ को हटाने के लिए । इस विधि का मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह लचीला है और अंय जीन भी मूल्यांकन किया जा सकता है, मानक आंतरिक संदर्भ जीन बदलने, ट्यूमर प्रकार और विशेषताओं के आधार पर ।
Protocol
Representative Results
Discussion
AR CN विश्लेषण में सीरम और प्लाज्मा नमूना बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर (सीआरपीसी) रोगियों के स्तरीकरण के लिए एक नया, गैर इनवेसिव दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है । यह हाल ही में प्रदर्शित किया गय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डाटा एनालिसिस में सपोर्ट के लिए हम चियारा Molinari और Filippo Martignano को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | – | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | – | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | – | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
