संश्लेषण और एक Ruthenium आधारित Mitochondrial कैल्शियम का मूल्यांकन
Summary
संश्लेषण, शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल, और एक ruthenium आधारित mitochondrial कैल्शियम का अवरोधक के लक्षण वर्णन प्रस्तुत किया है । permeabilized स्तनधारी कोशिकाओं में इसकी प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है.
Abstract
हम विस्तार के संश्लेषण और एक mitochondrial कैल्शियम की शुद्धि के लिए एक बहुत ही अवरोध करनेवाला, [(ओह2) (एनएच3)4आरयू (µ-O) आरयू (nh3)4(ओह2)]5 +। इस यौगिक के अनुकूलित संश्लेषण से शुरू [आरयू (nh3)5सीएल] सीएल2 में 1 एम एनएच4ओह एक बंद कंटेनर में, एक हरी समाधान उपज । शुद्धि कटियन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी के साथ पूरा किया है । इस यौगिक की विशेषता है और यूवी विज़ और IR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा शुद्ध होने के लिए सत्यापित किया जाता है । mitochondrial कैल्शियम निरोधात्मक गुण permeabilized हेला कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं ।
Introduction
Mitochondrial कैल्शियम प्रक्रियाओं है कि ऊर्जा उत्पादन और apoptosis सहित सामांय सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण है की एक संख्या के लिए एक प्रमुख नियामक है । 1 , 2 , 3 mitochondrial कैल्शियम uniporter (MCU), भीतरी mitochondrial झिल्ली पर रहता है कि एक आयन ट्रांसपोर्टर प्रोटीन, mitochondria में कैल्शियम आयनों की आमद को नियंत्रित करता है । 4 , 5 , MCU के 6 रासायनिक अवरोधकों समारोह और इस परिवहन प्रोटीन और mitochondrial कैल्शियम की सेलुलर भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयास जारी रखने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं । यौगिक [(HCO2) (nh3)4निय (µ-o) रॐ (NH3)4(हे2CH)]3 +, Ru360, एक के साथ MCU के लिए केवल ज्ञात चयनात्मक अवरोधकों में से एक है 24 µ m. 7 के एक रिपोर्ट Kd मान ,8,9,10 यह परिसर ruthenium लाल (RuRed), एक triruthenium di-µ-oxo पाटनी hexacation के सूत्र [(एनएच3) के व्यावसायिक नुस्खों में पाया गया एक आम नापाक है 5 आरयू (µ-o) आरयू (एनएच3)4(µ-o) आरयू (nh3)5)]6 +, जो भी एक कैल्शियम के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हालांकि Ru360 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, यह बहुत महंगा है । इसके अलावा, संश्लेषण और Ru360 के अलगाव कठिन शुद्धि प्रक्रियाओं और अस्पष्ट लक्षण वर्णन विधियों द्वारा चुनौती दी है ।
हम हाल ही में एक Ru360 एनालॉग का उपयोग करने के लिए वैकल्पिक प्रक्रियाओं की सूचना दी है, [(ओह2) (एनएच3)4आरयू (µ-O) आरयू (nh3)4(ओह2)] सीएल5. 11 यह यौगिक Ru360 के समान उच्च अपनत्व के साथ MCU को रोकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम इस यौगिक है, जो [आरयू (NH3)5सीएल] सीएल2से शुरू की हमारी सबसे प्रभावी संश्लेषण का वर्णन करेंगे । उत्पाद की शुद्धि दृढ़ता से अंलीय कटियन का उपयोग कर-विनिमय राल विस्तृत है, इस प्रक्रिया के लिए आम नुकसान के साथ । हम भी विशेषता और यौगिक शुद्धता के आकलन के लिए तरीके मौजूद है, और mitochondrial कैल्शियम चित्रित अवरुद्ध में इसकी प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक सरल तरीका है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
mitochondrial कैल्शियम की अधिकता को रोकना [(OH2) (एनएच3)4आरयू (µ-ओ) आरयू (nh3)4(OH2)] सीएल5 [आरयू (NH3)5cl] cl2से संश्लेषित किया जा सकता है, एक प्रसिद्ध ruthenium (III) शुरू सामग्री, के रूप में इस प्रक्रि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को कॉर्नेल विश्वविद्यालय ने समर्थन दिया था । यह काम सामग्री अनुसंधान के लिए कॉर्नेल केंद्र का उपयोग किया साझा सुविधाएं, जो NSF MRSEC कार्यक्रम (अनुदान DMR-११२०२९६) के माध्यम से समर्थन कर रहे हैं । S.R.N. एक NSF स्नातक अनुसंधान फैलोशिप (अनुदान डीजीई-१६५०४४१) और डॉ दवे Holowka कैल्शियम प्रयोगों के साथ सहायता के लिए द्वारा समर्थन स्वीकार करता है । किसी भी राय, निष्कर्षों, और निष्कर्ष या सिफारिशों इस सामग्री में व्यक्त लेखकों (ओं) के वे कर रहे है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के विचारों को प्रतिबिंबित ।
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
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