Ácidos graxos saturados induzir a morte celular de macrófagos associada a ceramida
Summary
Ilustramos um método direto para derivar murino macrófagos primários de células da medula óssea e um método simples para preparar o ácido graxo-BSA conjuga. Em seguida, demonstraremos que ácidos graxos saturados pode induzir a morte celular de macrófagos, e essa morte celular é positivamente associado com o acúmulo celular de ceramida níveis.
Abstract
Os macrófagos altamente expressam epidérmica proteína ligadora de ácidos graxos e adiposa proteína ligadora de ácidos graxos. Eles ativamente captação saturados e ácidos graxos insaturados, o que pode desempenhar um papel crítico na regulação de suas funções imunológicas. Numerosos estudos têm demonstrado que vários ácidos graxos saturados ou insaturado, podem possuir diferentes impactos sobre o crescimento celular e função. No entanto, variam as abordagens utilizadas para preparação de ácidos graxos, que pode conduzir a resultados não-fisiológica. Albumina de soro, um portador natural de ácidos graxos no sangue periférico dos mamíferos, é recomendada para formando um conjugado complexo com o sal de sódio de ácidos graxos para estudar a função do ácido graxo em células de mamíferos, minimizando assim a toxicidade do sabão de ácidos graxos. Assim, um simples, relativamente rápido aquecimento e sonicating método é desenvolvido e apresentado aqui para formação de conjugado ácida graxos BSA. Descreveremos um protocolo utilizando ácidos graxos saturados, especialmente os ácidos esteárico para induzir a morte celular grave em macrófagos derivado de medula óssea de rato. Mais demonstramos que a morte celular induzida por ácido graxo saturado é positivamente associada com níveis de ceramida celular acumulada. Esse método pode ser estendido para estudos do impacto do ácido graxo em outras células de mamíferos.
Introduction
Ácidos gordos desempenham um papel fundamental no metabolismo energético e na síntese de fosfolipídios da membrana em diferentes tipos de células. Ácidos graxos tem uma baixa solubilidade na água. Preparação adequada dos ácidos graxos é de importância crítica para estudar as funções biológicas de ácidos graxos em células de mamíferos. Quando os ácidos graxos são preparados com etanol, muitos ácidos graxos podem mostrar seu efeito tóxico sabão (detergente) na membrana celular, mesmo em concentrações relativamente baixas1. Como um transportador de ácidos graxos livres no soro natural, major, albumina de soro é considerada uma boa operadora para ácidos graxos entrega em vitro para ácidos graxos função ensaios2,3,4. No entanto, os detalhes da preparação do conjugado de ácido graxo e albumina geralmente não estão disponíveis mesmo que muitos trabalhos de pesquisa usando ácidos graxos têm sido publicados.
Os macrófagos altamente expressam epidérmica proteína ligadora de ácidos graxos e adiposa ácido graxo-ligação proteína5,6,7,8. Eles ativamente captação saturados e ácidos graxos insaturados que podem regular suas funções imunológicas. Para estudar o impacto dos ácidos graxos em macrófagos e outras células, diferentes métodos de preparação de ácidos graxos foram aplicadas1,7,9. Usar o ácido graxo adequadamente preparados/soro albumina conjugados para investigar o impacto dos ácidos graxos na função de macrófagos é de fundamental importância na obtenção de dados biologicamente significativos. Estudos sobre o impacto dos ácidos graxos na função do macrófago podem fornecer conhecimentos básicos e alvos terapêuticos relacionados com o metabolismo de ácidos graxos em macrófago envolvendo doenças.
Protocol
Representative Results
Discussion
A adequada preparação da solução de ácido graxo é de importância crítica para estudar a função biológica dos ácidos graxos. A neutralização do ácido graxo aumenta sua solubilidade em solução aquosa. Entretanto, sais de sódio de ácidos graxos, especialmente ácidos graxos saturados, são ainda de baixa solubilidade em água ou em PBS, como observamos. Um método é usar etanol 95 a 100% para ajudar a dissolver o ácido graxo1. Usando esse método, maior toxicidade às células po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado parcialmente pelos fundos de start-up de Universidade de Louisville e Instituto Nacional de câncer (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
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