さまざまな地域と発展途上と大人の脳のラミナを明らかにするシナプス亜鉛化学の使用
Summary
パターンの異なる脳の領域を染色特性の層流および面積の亜鉛を明らかに組織化学的手順をについて説明します。レイヤーと領域を開発、大人の脳を確実に区別するためにその他の解剖学的マーカーと亜鉛染色パターンは組み合わせて使用可能性があります。
Abstract
解剖学的および機能的な脳組織および開発の評価には、異なる神経回路と未熟な大人の脳の領域の正確な同定が必要です。ここで別のレイヤーと脳の間で染色パターンの違いを明らかにする亜鉛の組織化学的染色手順をについて説明します。他の人は亜鉛含有ニューロンと脳の回路の分布を明らかにするだけでなく、正常にいくつかの種の開発と大人の脳の面積と層流境界の線引きにもこのプロシージャを利用しています。ここで我々 は説明これ開発から画像とプロシージャを汚すと大人のフェレット脳。我々 はエリアのレイヤー、解剖学的マーカーとして機能する亜鉛染色パターンを明らかにして開発および成人の視覚野における視覚皮質を区別するために安心して使用できます。このプロトコルの主な目的は、レイヤーと他の方法がように失敗する発展途上と大人の脳の領域の正確な同定を可能にする組織化学的方法を提示することです。第二に、デンシトメトリーの画像解析と併せて、この方法により開発中の潜在的な変化を明らかにするためのシナプスの亜鉛の分布を評価するために 1 つです。このプロトコルは、試薬、ツール、および順次冷凍脳のセクションを染色に必要な手順の詳細について説明します。フェレット脳組織を使用してこのプロトコルを解説していますが、それは簡単に、齧歯動物、猫、または他の頭脳領域のように同様にサルでの使用に適応できます。
Introduction
組織学的汚れは伝統的建築の機能の違いを明らかにして様々 な種の皮質領野の同定の支援するために使用されています。ニッスル物質、チトクロム酸化酵素 (CO) 反応性ミエリンを組織化学的手法の併用は、成人の脳と同様の面積境界を明らかにする証明実り。しかし、これらの組織化学的汚れは皮質と未熟な脳の層の間の明確な境界を常に十分に明らかに行います。
中枢神経系における亜鉛の多数規制機能に参加してシナプス小胞の存在を通して神経調節物質として作用する酵素の補足因子としての DNA 構造の安定化を含むいくつかの重要な機能1。 それが視覚化できること組織学的手法を用いた蛋白結合亜鉛は可視化2をすることはできません一方、シナプス亜鉛はユニークな。この機能は、異なる皮質のシナプス亜鉛パターンを明らかにするために悪用されているし、組織化学シナプスの亜鉛は、多くの研究で使用されています。大脳皮質のグルタミン酸作動性ニューロンのサブセットには、その軸索ターミナル3,4内シナプス小胞中の亜鉛が含まれています。組織化学的研究は、大脳皮質の5,6,7でのシナプスの亜鉛の不均質分布を明らかにしました。異なる皮質領域 (例えば、体性感覚野と視覚的)、または層中の亜鉛の組織化学的反応性の異なる面積と層流分布をするようです (例えば亜鉛量は、顆粒と一次視覚野のではレイヤーが視床入力層 IV シナプス亜鉛の比較的低レベルでより大幅に高い)5,8,9。シナプスの亜鉛は、大脳皮質にみられる染色の不均一性は、面積と層流の識別を容易に特に有利であります。
Danscher の 1982年法10の修正版は、シナプスの亜鉛の化学プロシージャの詳細な説明をご紹介します。このメソッドは、キレート剤として、動物に亜セレン酸注入腹腔内 (IP) を利用しています。亜セレン酸は、脳内でグルタミン酸作動性シナプスのサブセットの小胞は、亜鉛のプールと反応する脳へ移動します。この反応は銀の開発2,,1011後高めることができる沈殿物を生成します。
この手順は、シナプス亜鉛の汚損; の層流および面積のパターンを明らかにします。デンシトメトリー分析は、感覚や環境、薬理学的、遺伝的操作など、他の介入の効果を研究する大人と未熟な脳で定性的・定量的にこれらのパターンを評価するために使用可能性があります。また、1 つはまた他のモデル系シナプス亜鉛その他の皮質や皮質下構造の分布の潜在的な発達的変化を評価しすることも。デンシトメトリーの分析を提供するこの方法で定量的な情報を時間をかけて次の脳の発達のために有利にすることができます。このプロトコルは、層流と地域の境界を明らかにする他の免疫・組織化学的マーカーにコンパニオンを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在の研究では、Danscher (1982) 法10、シナプス亜鉛の局在が検出され、脳で可視化するという修正版に基づく組織化学的手法を採用しています。このメソッドは本質的に亜鉛キレート剤ナトリウム亜セレン酸 (Na2SeO3) 動物 (15 mg/kg) を注入することによって動作します。注入後、亜セレン酸は脳に移動し、亜鉛亜鉛含有ニューロンのシナプス小胞にローカライズ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、研究資源 (2G12RR03060 26A1); 国立センターからの補助金によって支えられました。少数の健康および健康格差 (8G12MD007603-27) 国立衛生研究所から国立研究所プロフェッショナル スタッフ議会市立大学ニューヨーク (PSC ニューヨーク市立大学);教員の研究グラント (ドイツ連邦共和国 II) アメリカ大学シャルジャ.Vidyasagar Sriramoju は、これらのメソッドにご紹介を感謝いたします。
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
