一个简单的荧光记者的检测方法, 用于识别蓖麻毒素所需的细胞成分 a 链 (贸易协定) 贩运酵母

Summary

在手稿中, 我们描述了使用模型荧光记者分析, 以确定涉及的细胞成分的贩运和杀伤过程中的毒素 a 亚基的植物毒蓖麻。

Abstract

细菌和植物 A/B 毒素利用真核细胞的自然贩运途径达到其在胞的细胞内目标, 并最终杀死。这种/B 类毒素一般由酶活性 Asubunit (如、蓖麻毒素 A ()) 和一个或多个细胞结合 Bsubunit (s) 组成, 后者负责对特定细胞表面受体的毒素结合。我们目前对甲乙毒素如何能有效地令人陶醉的细胞的知识帮助科学家了解基本的细胞机制, 如吞和细胞内蛋白在更高的真核细胞中排序。从医学的角度来看, 同样重要的是要找出主要的毒素贩运路线, 为病人找到适当的治疗方案, 或最终发展治疗毒素的癌症治疗应用。

由于对哺乳动物细胞的 a/b 毒素贩运的全基因组分析是复杂、耗时和昂贵的, 因此在酵母模型生物体酿酒酵母中进行了关于 a/b 毒素转运的几项研究。尽管不那么复杂, 酵母和高真核细胞中的基本细胞过程是相似的, 而且在酵母中获得的结果往往可以转移到哺乳动物的情况。

在这里, 我们描述一个快速和易于使用的记者化验分析的细胞内贩运的酵母。这种新的检测方法的一个重要优点是, 不仅有机会从内质网 (er) 中研究胞, 而且从细胞膜到 ER 的吞和逆行毒素的转运。该分析利用了一个记者质粒, 允许间接测量在体内的绿色荧光蛋白 (GFP) 的荧光发射后,在活体翻译。由于贸易协定有效地防止了蛋白质生物合成的 28S rRNA depurination, 这一分析可以通过检测荧光发射的变化来识别细胞内的细胞间贸易中所涉及的宿主细胞膜蛋白。

Introduction

由毒素产生菌感染的病人是每个社会保健系统的严重的医疗和经济负担, 特别是因为有效的治疗治疗仍然很大程度上缺失。为了发展新的治疗策略, 在医学上相关的 a/b 毒素, 如霍乱毒素, 志贺毒素, 或蓖麻毒的复杂中毒机制, 需要在分子水平上充分了解, 基于新的强有力的化验, 必须实施。

近年来, 一些研究试图通过使用耗时和成本密集型的方法, 如放射性毒素标记^1,2以及 siRNA-based 筛选来分析酵母和哺乳动物细胞中的 a/b 毒素转运接近³。在某些情况下, 毒素贩运已被可视化的在体内荧光显微镜后, 与荧光, 量子点, 或荧光蛋白的单个毒素亚基的化学和/或遗传耦合^4,5。不幸的是, 这种修改往往导致不活泼和/或改变的自然性质的毒素。另一种可以间接回答各种科学问题的优雅方法是使用基于酶的记者系统, 如lacZ、荧光或荧光蛋白 (如GFP 或Discosoma sp. 红色荧光蛋白 (dsRed))。

在这篇手稿中, 一个简单的协议被描述为 extracellularly 在....

Protocol

注意: 一般实验工作流的概述如图 1所示。

警告: 对人类来说, 贸易协定是剧毒的。安全实验室许可 S2 (生物安全等级2当量) 是必要的。在整个实验中请戴上手套。

1. 在大肠杆菌中他标记的异种的异源表达

1. 用表达质粒 pET24-RTA_{(其) 6}或空向量 pET24a⁽⁺⁾使用标准的电穿孔协议^9,10转换大肠杆菌单元格。含有空质粒的细胞充当阴性对照。
2. 在含有卡那霉素的阳性克隆 (100 µg/毫升) lb 板后, 在5毫升_kan培养基 (lb 培养基与100µg/毫升卡那霉素) 中接种含有区域内表达质粒或空向量的细胞, 并在37° c 和 220 rpm 下孵育 24 h。
3. 补充 1 L LB_坎培养基与5毫升培养和孵育细胞在37° c 和 220 rpm 直到细胞达到了 OD₆₀₀ 0.8-1.0 (大约 3-4 h)。此后, 将培养温度降低到28° c, 并在 H₂O 中准备1米的 isopropyl-β-D-1-....

Results

本手稿中所描述的协议的一般工作流程在图 1中作了说明, 大致总结了成功的贸易协定纯化和随后的 GFP 报告实验的单一步骤。可以在协议中找到每个单独步骤的更详细的描述。图 2说明了通过亲和层析 (图 2A) 和空矢量控件 (图 2B) 成功进行的贸易协定净化的预期结果。图 2C显示了脱盐实验的典型结果, 说明了蛋白质峰值 (蓝色) 和盐-洗峰 (褐色) 的理想分离。在图 3中, 以马斯亮染色的 SDS 凝胶为形式, 提出了一种有效的贸易协定纯化方法。最后,图 4总结了由这个简单而健壮的 GFP-based 报告方法⁶

Discussion

在执行上述协议时, 我们建议以下建议, 以取得成功的实验结果。

对于异源蛋白的表达, 重要的是不超过 IPTG 浓度的1毫米。IPTG 的浓度和 #62; 1 mM 抑制启动子诱导的贸易量表达, 导致毒素产量降低。此外, 细胞不应在高于28° c 的温度下培养, 以防止包涵体形成、低效折叠和毒素失活。在较低的温度 (例如, 20-28 ° c) 是可能的, 也导致生物活性毒素的生产。然而, 额外的温度降低并没有显著改善贸易组织的活动/折叠, 结果在总毒素产量比28° c (数据没有显示)。

亲和层析 (表 1) 的纯化参数被优化为使用装有5毫升 Ni^{2 +}亲和柱的自动净化系统, 并应调整为其他自制或商业柱系统纯度和产量是次优。在不理想的马斯亮的情况下 (由额外的蛋白质的外观表明, 在多染的 SDS 凝胶), 增加的咪唑浓度的结合缓冲通常减少不结合的积极带电的蛋白质柱, 从而增加了总的贸易的纯度。在不理想的区域贸易量的情况下, 引入额外的可步骤 (4-8 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>细菌和酵母菌株
大肠杆菌 BL21 DE3（金）	Aligent Technologies	230130
酿酒酵母BY4742	Euroscarf	Y10000
酿酒酵母BY4742 缺失突变体	Dharmacon	YSC1054	整个系列
名称	Company	>目录号	评论
本协议中使用的质粒
pET24a（+） （Novagen）	Millipore	69772-3
pET-RTA（His6）	Becker et al. （2016）3
名称	Company	目录号	评论
试剂
酶 20T	USBio	Z1000.250	细胞壁裂解酶去除
LB 肉汤培养基	Thermo Scientific	10855021	加入 15 g 琼脂用于板生产
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
硫酸铵	Sigma-Aldrich	A4418-100G
不含亮氨酸的酵母脱落混合物	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
琼脂	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-棉子糖	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-山梨糖醇	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-半乳糖	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
咪唑	Roth	3899.1
PAGE标尺预染	发酵物	26616	蛋白质分子量标准<用于蛋白质免疫
strong>名称	Company	目录号<	strong>Comments
用于RTA纯化、脱盐和读取器测量的材料
分光光度计Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		旧型号，其他型号可用
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	旧型号，不再可用
&奥姆尔;KTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	产品停产并取代
HisTRAP HP 色谱柱	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP 脱盐柱	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart 无菌过滤器	Sartorius	16534K	0.2 µm 孔径
BCA 蛋白检测试剂盒	Pierce	23225
660 nm 检测试剂盒	Thermo Scientific	22660
96 孔板	Thermo Scientific	260860
名称	公司<	strong>目录号	评论
抗体（可选）
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	一抗;1：1,000 稀释
抗小鼠 HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	二抗，1：10,000 稀释度