Her beskriver vi teknik af sputum induktion. Denne protokol forklarer også sputum forarbejdning til at udføre en differentieret celletal og samle spyt supernatanten og celler for yderligere analyse.
Teknik af sputum induktion og forarbejdning er en anerkendt ikke-invasiv metode giver mulighed for indsamling og analyse af celler fra luftvejene, som er interessante i forskellige respiratoriske sygdomme som astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), kronisk hoste, eller idiopatisk pulmonal fibrose. Denne teknik er godt tolereret, sikker og ikke-invasiv, men er i øjeblikket begrænset til opslagstjenester og specialiserede centre i klinisk praksis, fordi det er teknisk krævende, tidskrævende, og kræver uddannet personale. Succesraten af sputum induktion og analyse er omkring 80%.
Her beskriver vi induktion og laboratorium behandling af sputum prøver. Spyt er foranlediget ved indånding af hypertonisk eller isotonisk saltvand med salbutamol. For behandlingen bruger vi hele sputum teknik. Dithiothreitol (DTT) bruges til at tillade mucolysis af sputum prøver. Det primære mål med spyt behandling er at opnå en differentieret celletal for at studere de nuværende i luftvejene lumen celletyper. Yderligere analyser kan også udføres på sputum supernatanten og sputum celler, som kan tillade yderligere undersøgelse af inflammatoriske processer og immun mekanismer. Eksempler kan nævnes at studere mæglere i sputum supernatanten og udføre et stort spektrum af analyse af sputum celler flowcytometri, genomforskning og proteomics.
Endelig, repræsentative resultater af sputum analyse i raske kontrolpersoner, astmatikere og KOL-patienter er præsenteret.
Flere metoder er brugt til at undersøge betændelse i luftvejene: direkte målinger (ligesom bronchiale biopsier eller bronchoalveolar lavages) og indirekte metoder (som symptom vurdering, blod prøve analyse og lunge-funktion test)1. De direkte teknikker har fordel af pålideligt vurdere betændelsen i luftvejene, men de er invasive og ikke lade sig gøre i stor skala på grund af patienternes ubehag og risikoen afholdt1. Hvad angår de indirekte metoder korrelerer de dårligt med en direkte vurdering af luftvejs inflammation1.
Sputum samling er en anden måde at prøve celler fra luftvejene og giver mulighed for en direkte vurdering af betændelse i luftvejene. Alligevel producerer spyt spontant kan føre til prøver af dårlig kvalitet og er ikke muligt for alle patienter2. Dette spørgsmål har overvundet ved hjælp af ultralyd forstøves hypertonisk saltvand til at fremkalde sputum produktion2. Denne metode blev oprindeligt anvendt hos patienter inficeret med human immundefekt virus (HIV) til diagnosticering af Pneumocystis carinii lungebetændelse3 og blev tilpasset til raske forsøgspersoner og astmatikere i 19924. Sputum induktion er også muligt i mere alvorlige patienter ved hjælp af isotonisk saltvand5. Selvom generelt veltolereret, kan indånding af saltvand forårsage bronkospasme hos patienter med hyperresponsive airways5. Det anbefales derfor, at administrere en korttidsvirkende beta-agonist før procedure1. Derudover har vi tidligere har vist, at tilføje salbutamol at saltvandsopløsning i den ultrasonisk forstøver yderligere faldt denne risiko6. Fordele af sputum induktion er at det er non-invasiv2 og sikker, når den passende forholdsregler er truffet5.
Til forarbejdning af sputum prøver, to metoder der i øjeblikket anvendes i litteraturen: hele sputum teknik og plug udvalg7. I vores laboratorium udføres den hele sputum teknik. Det primære mål med spyt behandling er at opnå en differentieret celletal for at studere typen af betændelse i luftvejene lumen. Mange yderligere analyser er dog også muligt for yderligere at undersøge inflammatoriske processer og immun mekanismer, enten ved at studere mæglere i sputum supernatanten8 eller ved at udføre detaljerede undersøgelse på sputum celler (f.eks. , flyde flowcytometri9, celle kulturer10, genomforskning10, proteomics10, immuncytokemi7, in situ hybridisering7, osv.)
Teknik af sputum induktion og analyse er i øjeblikket begrænset til forskning tjenester og specialiserede centre i klinisk praksis, fordi det er teknisk krævende, tidskrævende, og kræver uddannet personale1. Betændelse i luftvejene kan undersøges med denne metode for forskellige luftvejssygdomme såsom astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), kronisk hoste eller idiopatisk lungefibrose11.
Metoden provokeret sputum er et nyttigt redskab til at undersøge luftvejene rum. Der er flere mulige anvendelser af denne teknik. Først, kan det forbedre viden om immunceller og mekanismer involveret i forskellige luftvejssygdomme. For eksempel, denne teknik har tilladt undersøgelsen af luftvejs inflammation i store kohorter af patienter, og det har vist at ca. halvdelen af astmatiske patienter er karakteriseret ved en unormal luftvejene eosinofil inflammation15, 16 , 17, mens KOL patienter normalt udviser en hævet spyt neutrofile tæller18. Denne teknik har også bidraget til bedre karakterisering af luftvejs inflammation hos patienter med idiopatisk lungefibrose og beviser mæglere, der kan bidrage til denne sygdom19. Andet kan teknik af provokeret sputum være nyttigt at forudsige respons på behandlingen. For eksempel, har tilstedeværelsen af en unormal procentdel af sputum eosinofile vist sig at være en intelligent markør af kortikosteroid lydhørhed11,18. I astma og KOL, blev skræddersy dosis af kortikosteroider til at normalisere procentdelen af sputum eosinofile vist sig at være mere effektiv i faldende antallet af eksacerbationer end justere behandling i henhold til de aktuelle kliniske retningslinjer11 ,20,21. For det tredje, sputum analyse kan bidrage til at udvikle målrettede behandlinger. For eksempel, har tilstedeværelsen af en unormal antal sputum neutrofiler i KOL og nogle astmatisk patienter ført til udviklingen af antineutrophilic behandlinger11. For det fjerde, teknikken kan spille en rolle i diagnose. For eksempel, er tilstedeværelsen af sputum eosinofili nødvendigt at stille en diagnose af ikke-astmatiker eosinofil bronkitis11.
Udover at opnå en differentieret celletal, en teknik, inducerende sputum giver også mulighed for udførelsen af mange yderligere analyser, ved at studere enten sputum supernatanten eller sputum celler. Eksempler med spyt supernatanten analyse af mæglere8,19,22 og vurdering af stikprøve for eosinofile22kemotaktisk aktivitet. Fra sputum celler, RNA kan udvindes og anvendes til mikroRNA eller genekspression analyserer19,23 . Sputum cellerne kan også analyseres af flow flowcytometri9,23 , som giver mulighed for blandt andet Immunofænotypning og sortering celler. Derudover sputum celler kan være kulturperler10, og deres mægler produktion kan være målte in vitro-24. Det er værd at bemærke, at i dette tilfælde, mægler indhold er forskellige fra hvad kan findes i spyt supernatanten. Faktisk, mæglere i sputum supernatanten kan være påvirket af sekret fra luftvejene bosiddende celler og plasma udsondring, i modsætning til sputum celle kultur model24. Endelig kan immuncytokemi og i situ hybridisering også udføres ved hjælp af sputum celler7.
Provokeret sputum teknik har nogle begrænsninger. Induktion skal udføres under lægeligt tilsyn. Det er også afgørende for den erhvervsdrivende til at give grundig vejledning til patienter. Andre begrænsninger omfatter samarbejde og medicinsk tilstand af patienter, som respiratoriske indsats. Med hensyn til gennemførligheden af denne teknik i børn, flere undersøgelser har rapporteret, at det var vellykket og sikker hos børn ældre end 6 år25. Data om børn af < 6 år mangler25, men det er sandsynligt, at spyt induktion er vanskelig at udføre i disse børn14. Teknikken er i øjeblikket begrænset til forskning tjenester og specialiserede centre, fordi det er teknisk krævende, tidskrævende, og det kræver uddannet personale1. En anden begrænsning er, at teknikken af sputum induktion og analyse ikke er altid vellykket, hvilket betyder, at en læsbar cytospin ikke altid opnås26. Men succesraten er normalt omkring 80% i forskellige kohorter af patienter4,26,27,28,29. Endelig skal udvises forsigtighed, når man sammenligner forskellige kohorter af patienter med hensyn til matching af alder, som det blev vist at påvirke sputum celle tæller30,31. På samme måde har andre parametre såsom køn og tobak vaner at blive matchet, da de kan også påvirke sputum celle tæller29,32. Når patienten matchende ikke er muligt, er en anden måde at tage hensyn til alder, køn eller rygning status justere den statistiske analyse for disse variabler.
Sammenlignet med andre teknikker, der tillader indsamling celler fra luftvejene, ligesom biopsier og bronchoalveolar lavages, har provokeret sputum metode fordelene ved at være simpelt, veltolereret, sikker, reproducerbar, omkostningseffektiv og non-invasiv. Disse fordele tillade provokeret sputum teknik skal udføres på en stor skala og gentagne gange over tid, og gøre det en alternativ valg for luftvejene prøveudtagning. Bronchosorption er en anden teknik, der tillader indsamling af slimhindebelægning væske for at vurdere luftvejene mæglere33. Mens denne teknik (kræver bronkoskopi) er mere indgribende end provokeret sputum, har det fordele af at undgå enhver form for kontaminering med spyt og opnå højere koncentrationer af mæglere end i bronchoalveolar lavage33.
Kritiske trin kræver opmærksomhed i protokollen. Først, forsigtighed skal tages vedrørende den saltholdige koncentration og tid af induktion, fordi disse to parametre kan påvirke resultaterne og skal derfor være standardiserede34,35. Andet, mucolysis med DTT er et vigtigt skridt i behandlingen. Forhold til PBS, blev DTT vist at bedre sprede sputum celler7, som forbedrer cytopsin slide kvalitet og er vigtigt at have en reproducerbar celle tæller2. Men den slimløsnende middel kan interferere med måling af biokemiske komponenter.Spiking eksperimenter skal derefter udføres, når du måler en ny biokemiske sammensatte36. Endelig, en anden kritisk trin af proceduren er cellen tælle skridt, som skal udføres af en uddannet tekniker at sikre pålidelige og fortolkelige resultater.
En alternativ metode ved hjælp af sputum stik (viscid eller tættere dele), i stedet for hele spyt er også beskrevet i litteraturen7. Begge teknikker har fordele og ulemper. Hele sputum teknik giver mulighed for hurtigere behandling7, men er ofte forurenet med spyt, som udvander prøven og kan forringe kvaliteten af cytospins2,7. Med plug udvalg teknik, er spyt forureningen reduceret, hvilket betyder, at prøver ofte er af bedre kvalitet for dosering af flydende fase mæglere og cytospin dias7. Behandlingen er dog længere7 og valgte stik kan ikke være repræsentative for hele stikprøven37. Det er også værd at bemærke, at ikke alle prøver indeholder stik, som kan være begrænsende. Begge metoder er valideret og reproducerbar, og der er i øjeblikket ingen beviser, at differentieret celle tæller fra begge disse metoder er forskellige14,38.
I fremtiden, kunne provokeret sputum bruges som et klinisk værktøj til at give biomarkører for undersøgelse, diagnose og forvaltning af alle former for inflammatoriske luftvejssygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af University Hospital af Liege (CHU Liege). Vi anerkender “Øjeblikke produktioner” for video-produktion. Vi anerkender også Cedric François, patienten, der dukkede op i filmen.
Spirometer – Spirobank | MIR France | ||
Salbutamol MDI – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0135-913 | See drug available in the country |
Nebulizer UltraNeb | DeVilbiss Healthcare USA | UltraNeb U3000 | |
Devilbiss UltraNeb Disposable Cups & Lids | DeVilbiss Healthcare USA | 100HD-647 | |
DeVilbiss Bacterial Filter For UltraNeb Nebulisers | DeVilbiss Healthcare USA | 1001005879 | |
One-way Valves | Hudson RCI USA | 41664 | |
One-way Valves | Hudson RCI USA | 41665 | |
Aerosol T-connector | Hudson RCI USA | 41077 | |
Ventilation circuit monobranch corrugated | Int'Air Medical France | TA30A | |
NaCl 5 % | / | / | Produced by our hospital pharmacy |
Mini-Plasco NaCl 0.9% | B.Braun Medical Diegem Belgium | ||
Salbutamol sulfate 5 mg/mL – Ventolin | GLAXOSMITHKLINE | CNK: 0094-987 | See drug available in the country |
Ipratropium bromide 0.25 mg/2 mL – Atrovent | Boehringer Ingelheim Germany | CNK: 1543-305 | See drug available in the country |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | LONZA Belgium | BE17512F | |
Sputolysin reagent | Calbiochem | 56000 | |
Trypan blue 0.4% solution 100 mL | LONZA Bio Whittaker Belgium | 17-942E | |
Hemocytometer – Thoma chamber | Labor Optik Lancing UK | 1500000 | |
Hemacolor Stainig set | Merck Belgium | 1116610001 | Alternative product : Diff Quik Staining Set Medion Diagnostic |
Mounting medium – Entellan | Merck Belgium | 107960 | |
Statspin Cytofuge 12 | Beckman Coulter Belgium | X00-003066-001 |