유체역학 꼬리 정 맥 주입 transposon 기반 통합 벡터의 수 murine hepatocytes의 안정 되어 있는 transfection vivo에서. 여기, 우리는 단일 transgene의 장기 제정 식 또는 결합 된 제정 및 doxycycline 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 간에서 미르 shRNA 있도록 transfection 시스템을 위한 실용적인 프로토콜 제시.
간 암, 재생, 염증, 섬유 증의 연구 모델에서 vivo에서 유전자 발현 및 침묵에 대 한 유연한 시스템은 매우 유용 합니다. 유체역학 꼬리 정 맥 주입의 transposon 기반 구문 성인 쥐 hepatocytes의 유전자 조작에 대 한 효율적인 방법입니다. 제정 transgene 식 이외에 유전자 돌연변이 유도 하는 CRISPR/Cas9 시스템 또는 유도할 수 있는 시스템의 shRNA 중재 유전자 노크 다운, 의미 같은 고급 응용 프로그램에 대 한이 시스템을 사용할 수 있습니다. 여기는 transgene의 유도할 수 있는 표정과 함께 제정 있다 식의 조합 또는 선택의 미르 shRNA이 기술의 예로 제공 됩니다. 우리는 잠자는 미녀의준비에서 시작 하는 다단계 절차를 커버-transposon, 주입 및 마우스의 처리 및 분석에 대 한 간 조직 준비 하 여 구성 immunostaining. 제시 하는 시스템은 hepatocytes에서 복잡 한 유전자 조작을 달성 하기 위해 안정적이 고 효율적인 접근 이다. 그것은 Cre/loxP 기반 마우스 종자와 함께에서 특히 유용 하 고 다양 한 간 질환의 연구에서 모델에 적용할 수 있습니다.
만성 간 질환 주요 건강 부담 전세계1를 선물 한다. 동물 연구 모델 간 질환의 연구에 필수적인 도구 이며, 간 재생, 간 염증, steatosis 뿐만 아니라 간 암2에 복잡 한 질문에 대답 하는 데 도움이. 이러한 동물 모델의 상당수는 간 세포의 유전 수정에 의존합니다. 따라서, hepatocytes에 유전자 발현을 조작 하는 효율적인 도구는 도움이3. 유전자 조작된 마우스 종자의 번 식 또는 hepatocyte 감염에 대 한 바이러스 성 벡터의 생성 등 설립된 방법 중 시간이 걸리고, 항구 안전 우려, 또는 vivo에서 hepatocytes에서 가난한 transgene 식 양보 4 , 5. 유체역학 꼬리 정 맥 주입 (HTVI) 간에서 유전자 기능, 빠른, 쉽고 비용 효율적인 심문 허용 hepatocytes의 transfection 비보에 대 한 대체 방법입니다. HTVI에 대 한 원하는 DNA 시퀀스를 들고 벡터 주입 된 동물의 몸 무게의 10%에 해당 하는 염 분의 볼륨에 녹입니다. 솔루션은 다음 5-10의6이내 꼬리 정 맥에 주입 됩니다. 심장 출력을 초과, 고 염 분에서에서 흐름 열 등 한 베 나 정 맥 간 확장 및 hepatocytes7의 유체역학 transfection 간 정 맥으로. 안정적인 게놈 통합을 달성 하기 위해 메서드 자 아름다움-transposon 시스템 등 transposon 기반 벡터와 결합 하고있다. 이 시스템 게놈 재결합 사이트 자 아름다움-transposase8,9에 의해 촉매와 대상 벡터의 재결합을 중재 한다. 간 섬유 증 또는 발암 모델, 그것은 종종 overexpress 또는 침묵 유전자 질병 모델의 특정 시간 지점에서 하는 것이 좋습니다. 이 목적에 대 한 Cre/LoxP 시스템 등 항생물질을 유도할 수 있는 유전자 표현 시스템 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한 도구 (Tet에서) 사용된10될 수 있습니다.
여기, 우리가 잠자는 미녀 transposon-기반 시스템의 HTVI를 사용 하 여 murine hepatocytes의 transfection 비보에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리가 제정 tamoxifen 종속 Cre recombinase (크리스챤) 식으로 결합 하는 고급 벡터 시스템을 설명 하는 간 전용 모터의 제어 transgene의 안정적이 고 구성 적인 표현 위한 프로토콜 이외에 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 예측에 관한 적응 shRNA (미르-shRNA), pTC 라는 TET 시스템11. 이 벡터 시스템에서 유도할 수 있는 transgenes 또는 항생물질 종속 식 미르-shRNAs recombinational 복제 시스템, 새로운 벡터12의 신속 하 고 쉽게 생성 수 있도록 백본 벡터에 복제 됩니다. 이 비디오 기반 가이드 유도할 수 있는 transgene/미르-shRNA 식 달성에 적합 한 벡터, 주입 및 쥐의 치료의 준비 그리고 마지막으로 간 조직 분석에 대 한 준비를 다루고 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 식과 Cre/loxP 중재 마우스 시스템의 조합 또는 간 질환의 연구에 널리 적용 가능한 시스템을 만드는 선택의 어떤 유전자의 노크 다운 수 있도록 설계 되었습니다.
유체역학 꼬리 정 맥 주사로 hepatocytes의 transfection 되고있다 설립된 방법 그것의 소개부터 15 년 이상 전6. 주입 된 볼륨 심장 출력을 초과 하 고 간7, 어떤 경우에 약 10-20%의 transfection hepatocytes25,26의 40%까지 이어지는의 사인으로 열 등 한 베 나 정 맥에서 흐른다. 예언자는 성공적인 transfection 주입된 시간22<…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 독일 Krebshilfe, 독일 (부여 번호 111289 UE), 어린이 건강 (어니스트와 아멜리아 Gallo 부여 박사 원정대-CTSA 보조금 번호 UL1 RR025744 UE)의 루 패 커드 재단에 의해 지원 되었다. 우리는 벡터 구문에 대 한 박사 마크 A. 케이 감사 하 고 실험 조언과 박사 줄리앙 세이 지 마우스이 고 실험적인 지원.
General Material | |||
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Restriction Enzymes | |||
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
AscI | New England BioLabs | R0558S | |
FseI | New England BioLabs | R0588S | |
SacI | New England BioLabs | R0156S | |
SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits | |||
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials for Mouse Experiments | |||
Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |