流体の尾静脈注射を使用してマウス肝細胞の生体内で遺伝的変更の構成および誘導システム
Summary
トランスポゾン ベースの統合のベクトルの流体尾静脈注射によりマウス肝細胞の安定したトランスフェクション体内。長期的な単一遺伝子の発現や遺伝子や肝臓でミール shRNA の組み合わせ構成とドキシサイクリン誘導式ことができますトランスフェクション システムの実用的なプロトコルを紹介します。
Abstract
肝臓癌や再生、炎症、線維症の研究モデル、生体内で遺伝子発現と沈黙のための柔軟なシステムは非常に便利です。トランスポゾンによる構造の流体尾静脈注射は、成体マウスの肝細胞の遺伝的操作のための効率的な方法です。構成遺伝子発現、に加えてこのシステムは shRNA を介した遺伝子ノックダウン、含意の遺伝子の突然変異誘発に CRISPR/Cas9 システム誘導システムより高度なアプリケーションで使用できます。ここでは、transgene の発現とともにクレエ発現の組み合わせ、または選択のミール shRNA はこの技法の例として提示されます。我々 は眠れる森の美女の準備から始まってマルチ ステップの手順をカバー-トランスポゾン構築、注入とマウスの治療と肝組織の分析のための準備をしています。紹介システムは、肝細胞の複雑な遺伝的操作を達成するために信頼性の高いかつ効率的なアプローチです。具体的にはマウス系統の Cre/loxP ベースとの組み合わせで役に立つ、さまざまな肝臓病の研究ではモデルに適用することができます。
Introduction
慢性肝疾患は、主要な健康負担世界1を提示します。動物の研究モデルは肝臓病の研究に不可欠なツール、肝再生、肝炎症脂肪肝と肝細胞癌2複雑な質問に答えることを助けた。これらの動物モデルの相当な数は肝細胞の遺伝子の組み換えに頼る。したがって、肝細胞における遺伝子発現を操作するための効率的なツールは、参考3。遺伝子組み換えマウス系統の繁殖や肝細胞感染のウイルスのベクトルの生成などの確立された方法はいずれかの時間がかかり、港安全性の懸念、または体内肝細胞遺伝子発現の低下をもたらす4,5. 流体尾静脈注射 (HTVI) は肝臓での遺伝子機能の簡単、高速、かつコスト効率の高い尋問を可能にする肝細胞の生体内でtransfection のための代替方法です。HTVI、生理食塩水注入された動物の体重の 10% に相当する量に必要な DNA シーケンスを運ぶベクターを溶解しています。ソリューションは、5-10 の6で尾静脈にそれから注入されます。心拍出量を超える場合、生理食塩水は下大静脈から肝臓の拡大と肝細胞7の流体のトランスフェクションにつながる、肝静脈に流れます。安定的なゲノムの統合を達成するためにメソッドは、トランスポゾンを用いたベクトルで寝ている美 –トランスポゾン システムなど結合されています。このシステムは、触媒による睡眠美容 –トランスポザーゼ8,9ゲノム再結合サイトとターゲット ベクトルの再結合を仲介します。肝線維症や発癌のモデル、それが疾患モデルの特定の時点で過剰または沈黙遺伝子に望まれます。この目的のための Cre/LoxP システムやテトラサイクリン誘導性の遺伝子発現系など誘引可能な遺伝子発現のツール (テトで) 使用される10があります。
ここでは、眠れるトランスポゾン ベースのシステムの HTVI を使用してマウス肝細胞の生体内でtransfection のためプロトコルについて述べる。タモキシフェン依存 Cre リコンビナーゼ (クレエ) 発現とを組み合わせてより高度なベクトル システムについて述べる肝特異プロモーターの制御下導入遺伝子の安定した、構成式のプロトコルに加えて、発現遺伝子のマイクロ Rna に適応した shRNA (ミール shRNA)、呼ばれる pTC テト システム11。このベクター システムの誘引可能な遺伝子またはテトラサイクリン発現のミール Shrna は過剰クローニング システム、新しいベクトル12の迅速かつ簡単の生成を許可するバックボーン ベクターにクローン作成します。このビデオ ベースのガイドには、遺伝子/ミール-shRNA 発現を達成するために適切なベクトル、注入およびマウスの治療の準備と最終的に肝組織の分析のための準備について説明します。このプロトコルで説明する方法は、式に Cre/loxP を介したマウス システムの組み合わせまたは肝臓病の研究に広く適用可能なシステムを作り、好みのあらゆる遺伝子のノックダウンを有効に設計されました。
Protocol
すべての動物実験管理と実験動物の使用のためのガイドラインに従って行われ、(Regierung ・ フォン ・ インゴルシュタット、ミュンヘン、ドイツとスタンフォード施設動物ケアおよび使用委員会の責任がある権限によって承認されました。スタンフォード、カリフォルニア州、米国)。(ステップ 4 で 1) のクローニングのためのすべてのプラスミドの一覧は、別表 S1 で提供されます。 <p class…
Representative Results
流体尾静脈注射によってトランスフェクションの有効性:単一の注入による力学トランスフェクションがマウスの肝細胞の割合は変数、注入量、注入時間、注入された DNA の量と注入された構築6、サイズなど複数のパラメーターに依存します。 22,23。また、トランスフェクション効率は…
Discussion
流体尾静脈注射で肝細胞のトランスフェクションとなっている確立された手法、導入以来 15 年以上も前6。噴射量は心拍出量を超えるし、肝臓の7肝細胞25,26の 40% まで約 10-20%, いくつかのケースでのトランスフェクションにつながる正弦波に下大静脈から流れます。成功したトランスフェクションの予測因子は、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ドイツの Krebshilfe、ドイツ (許可番号 111289 UE に)、子供の健康 (アーネスト ・ アメリア ガロ恵まれて員 – CTSA 許可番号 UL1 RR025744 UE) ルシール パッカード財団によって支えられました。博士マーク a. ケイありがとうベクトル構造と実験的アドバイスや Dr ジュリアン セージ マウスの実験をサポートします。
Materials
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
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Cite This Article
Hubner, E. K., Lechler, C., Rösner, T. N., Kohnke-Ertel, B., Schmid, R. M., Ehmer, U. Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection. J. Vis. Exp. (132), e56613, doi:10.3791/56613 (2018).