गठन और Inducible सिस्टम के लिए आनुवंशिक Vivo में संशोधन माउस हेपैटोसाइट्स का उपयोग Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन
Summary
transposon-आधारित एकीकरण वैक्टर के Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन vivo में murine हेपैटोसाइट्स के स्थिर अभिकर्मक को सक्षम बनाता है । यहां, हम अभिकर्मक प्रणालियों के लिए एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल है कि एक एकल transgene या संयुक्त गठन और जिगर में एक transgene या मीर-shRNA की doxycycline-inducible अभिव्यक्ति की लंबी अवधि के गठन की अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है के लिए प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
यकृत कैंसर के अनुसंधान मॉडल में, पुनर्जनन, सूजन, और फाइब्रोसिस, vivo जीन अभिव्यक्ति और मुंह में के लिए लचीला प्रणालियों अत्यधिक उपयोगी होते हैं । transposon के Hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन-आधारित constructs वयस्क चूहों में हेपैटोसाइट्स के आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक कुशल तरीका है । गठन transgene अभिव्यक्ति के अलावा, इस प्रणाली ऐसे shRNA के रूप में और अधिक उंनत अनुप्रयोगों, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जीन दस्तक नीचे, CRISPR/Cas9 प्रणाली के निहितार्थ को जीन उत्परिवर्तनों, या inducible प्रणालियों प्रेरित । यहां, एक transgene या मीर की inducible अभिव्यक्ति के साथ मिलकर गठित CreER अभिव्यक्ति का संयोजन-पसंद के shRNA इस तकनीक का एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया है । हम बहु कदम प्रक्रिया को कवर स्लीपिंग ब्यूटी-transposon निर्माण की तैयारी से शुरू, इंजेक्शन और चूहों के उपचार के लिए, और immunostaining द्वारा विश्लेषण के लिए जिगर ऊतक की तैयारी. प्रस्तुत प्रणाली हेपैटोसाइट्स में जटिल आनुवंशिक जोड़तोड़ को प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल दृष्टिकोण है । यह विशेष रूप से Cre/loxP-आधारित माउस उपभेदों के साथ संयोजन में उपयोगी है और जिगर की बीमारी के अनुसंधान में मॉडलों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
जीर्ण जिगर की बीमारी एक प्रमुख स्वास्थ्य बोझ दुनिया भर में1प्रस्तुत करता है । पशु अनुसंधान मॉडल जिगर की बीमारी के अध्ययन में आवश्यक उपकरण है और जिगर पुनर्जनन, यकृत शोथ, और steatosis के रूप में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जिगर कैंसर2में जटिल सवालों के जवाब में मदद मिली है । इन जानवरों के मॉडल की एक पर्याप्त संख्या जिगर की कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन पर भरोसा करते हैं । इसलिए, कुशल उपकरण हेपैटोसाइट्स में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए सहायक है3। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस उपभेदों या hepatocyte संक्रमण के लिए वायरल वैक्टर की पीढ़ी के प्रजनन के रूप में स्थापित तरीकों या तो समय लेने वाले हैं, बंदरगाह सुरक्षा चिंताओं, या हेपैटोसाइट्स में उपज गरीब transgene अभिव्यक्ति में vivo 4 , 5. Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन (HTVI) जिगर में जीन समारोह के आसान, तेज, और लागत कुशल पूछताछ के लिए अनुमति हेपैटोसाइट्स के vivo अभिकर्मक में एक वैकल्पिक तरीका है । HTVI के लिए, एक वेक्टर वांछित डीएनए अनुक्रम ले जाने इंजेक्शन जानवर के शरीर के वजन का 10% करने के लिए इसी खारा की मात्रा में भंग कर रहा है । समाधान तो 5-10 एस के भीतर पूंछ नस में इंजेक्शन है6। हृदय उत्पादन से अधिक, वेना कावा से खारा बहती जिगर की नसों में, जिगर के विस्तार के लिए अग्रणी और हेपैटोसाइट्स के hydrodynamic अभिकर्मक7. स्थिर जीनोमिक एकीकरण प्राप्त करने के लिए विधि को transposon आधारित वैक्टर के साथ जोड़ा गया है, जैसे कि स्लीपिंग ब्यूटी-transposon सिस्टम । यह सिस्टम जीनोमिक पुनर्संयोजन साइटों के साथ लक्ष्य वैक्टर के संयोजन मध्यस्थता एक सोने की सुंदरतासे catalyzed-transposase8,9. जिगर फाइब्रोसिस या कैंसरजनन के मॉडलों के लिए, यह अक्सर व्यक्त या रोग मॉडल के कुछ समय बिंदुओं पर मौन जीन के लिए वांछनीय है । इस प्रयोजन के लिए, inducible जीन व्यंजक जैसे Cre/LoxP-प्रणाली या टेट्रासाइक्लिन-inducible जीन अभिव्यक्ति प्रणाली (Tet-On) के लिए उपकरण10का उपयोग किया जा सकता है ।
यहां, हम एक सो सौंदर्य transposon आधारित प्रणाली के HTVI का उपयोग कर murine हेपैटोसाइट्स के vivo अभिकर्मक में के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । के लिए एक प्रोटोकॉल के अलावा स्थिर, एक जिगर के नियंत्रण के तहत एक transgene के गठन की अभिव्यक्ति विशेष प्रमोटर, हम एक और अधिक उंनत वेक्टर प्रणाली है कि गठन tamoxifen-निर्भर Cre recombinase (CreER) अभिव्यक्ति के साथ जोड़ती है का वर्णन एक transgene या microRNA के inducible अभिव्यक्ति-अनुकूलित shRNA (मीर-shRNA), pTC TET-प्रणाली11कहा जाता है । इस वेक्टर प्रणाली में, inducible transgenes या मीर-shRNAs टेट्रासाइक्लिन-निर्भर अभिव्यक्ति के लिए एक पुनर्संयोजनीय क्लोनिंग प्रणाली के साथ रीढ़ वेक्टर में क्लोन कर रहे हैं, की अनुमति तेजी से और आसान पीढ़ी के नए वैक्टर12। इस वीडियो आधारित गाइड उपयुक्त वैक्टर, इंजेक्शन और चूहों के उपचार inducible transgene/मीर-shRNA अभिव्यक्ति को प्राप्त करने की तैयारी को शामिल किया गया है, और अंत में विश्लेषण के लिए जिगर ऊतक की तैयारी । इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि किसी भी Cre के संयोजन को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था/loxP मध्यस्थता माउस प्रणाली अभिव्यक्ति के साथ या किसी भी पसंद के जीन की दस्तक, यह जिगर की बीमारी के अनुसंधान में एक व्यापक रूप से लागू प्रणाली बना रही है.
Protocol
Representative Results
Discussion
hydrodynamic पूंछ नस इंजेक्शन के साथ हेपैटोसाइट्स के अभिकर्मक अपने परिचय से अधिक 15 साल पहले6से एक स्थापित विधि बन गया है । इंजेक्शन मात्रा कार्डियक आउटपुट से अधिक है और जिगर के sinusoids में अवर वेना कावा से ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को ड्यूश Krebshilfe, जर्मनी (अनुदान संख्या १११२८९ यत), Lucile पैकार्ड फाउंडेशन फॉर चिल्ड्रन हेल्थ (अर्नेस्ट एण्ड अमेलिया Gallo संपन्न Postdoctoral फैलोशिप-CTSA अनुदान संख्या UL1 RR025744 से यत) का समर्थन प्राप्त था. हम dr मार्क A. Kay के लिए वेक्टर का निर्माण और प्रयोगात्मक सलाह और चूहों और प्रयोगात्मक समर्थन के लिए डॉ जुलिएन ऋषि धन्यवाद ।
Materials
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
References
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
