האתר מכוון הנייח של עצם Morphogenetic חלבון 2 משטחים מוצקים על ידי לחץ על כימיה
Summary
Biomaterials מסטול עם 2 חלבון Morphogenetic (BMP2) עצם שימשו בתור אסטרטגיה טיפולית חדשה ריפוי שברים בעצמות, והמעלית. כדי להתגבר על תופעות לוואי הנובעות שחרור בלתי נשלט של הגורם, אנו מציעים אסטרטגיה חדשה באתר-ישירות לשתק את הגורם, ובכך ליצור חומרים עם יכולות osteogenic משופר.
Abstract
אסטרטגיות טיפוליות שונות לטיפול של ריפוי ללא פגמים עצם נחקרו באינטנסיביות. כעת בשימוש טיפולי נוכח מספר מגבלות שהובילו לכך השימוש biomaterials בשילוב עם גורמי גדילה osteogenic, כגון עצם morphogenetic חלבונים (BMPs). שיטות הקליטה או כימוס נפוץ דורשים כמויות העל-פיזיולוגיים של BMP2, בדרך כלל והתוצאה אפקט שחרור פרץ הראשונית כביכול מעורר מספר תופעות לוואי לוואי חמורות. אסטרטגיה אפשרית כדי להתגבר על בעיות אלה יהיה covalently הזוג החלבון אל הגרדום. יתר על כן, צימוד צריכה להתבצע באופן ספציפי לאתר על מנת להבטיח תוצאה המוצר לשחזור. לכן יצרנו משתנה BMP2, שבה חומצת אמינו מלאכותיים (propargyl-L-ליזין) הוצג לתוך החלק הבוגר של החלבון BMP2 על ידי הרחבת השימוש codon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk היה מצמידים חרוזים functionalized דרך נחושת מזורז אזיד-אלקין cycloaddition (CuAAC). פעילות ביולוגית בשילוב BMP2-K3Plk הוכח במבחנה , הפעילות osteogenic של חרוזים BMP2-K3Plk-functionalized ‘ הוכח בהתא המבוסס על מבחני. החרוזים functionalized במגע עם תאים C2C12 הצליחו לגרום ביטוי phosphatase אלקליין (ALP) בסמיכות מקומית מוגבלת של החרוז. לפיכך, על-ידי טכניקה זו, פיגומים functionalized יכול להיות מיוצר זה יכול לעורר תאית התמיינות לכיוון השושלת osteogenic. בנוסף, במינונים נמוכים BMP2 מספיקים בגלל הכיוון מבוקרת של האתר מכוון BMP2 בשילוב. בשיטה זו, BMPs נחשפים תמיד שלהם הקולטנים על פני השטח תא בכיוון המתאים, אשר אינה המקרה אם הגורמים הם מצמידים באמצעות טכניקות צימוד בוים אתר. התוצאה המוצר הוא מאוד לשליטה ועצמות, לפיכך, תוצאות בחומרים עם מאפייני הומוגנית, שיפור שלהם הישימות עבור התיקון של גודל קריטי פגמים.
Introduction
המטרה הסופית של התחדשות העצם והנדסה רקמת העצם היא להתגבר על חסרונות ומגבלות המתרחשים במהלך הטיפולים הנפוצים של שברים, והמעלית. Auto – או מאפשר-השתלות משמשים בעיקר אסטרטגיות טיפול הנוכחי, אף-על-פי לשניהם יש מספר חסרונות. השתל עצם אידיאלי אמורות לגרום פרכת על ידי osteoinduction, כמו גם osteoconduction, שמוביל osteointegration של השתל לתוך העצם. כיום, הוא רק אוטומטית-השתלת נחשב “תקן הזהב” מאז שהיא מספקת כל מאפייני והנערה אידיאלי. למרבה הצער, הוא גם מציג היבטים שליליים חשובים, כגון ניתוח ארוך פי אתר הטראומה השנייה בדרך כלל כרוך סיבוכים יותר (למשל, כאב כרוני, תצורות שטף דם, זיהומים, פגמים קוסמטיים, וכו ‘). השתלים allogenic, לעומת זאת יש מאפייני שיוצרת עבור כל ההיבטים כללי1. טכנולוגיות שתל עצם חלופי שופרו בבשנים האחרונות, במטרה לייצר פיגומים כי הם osteoinductive, osteoconductive, מסתיימים, ו- bioresorbable. מאז biomaterials רבים אינם מראים כל אלה מאפיינים osteogenic, גורמי גדילה שונים, בעיקר BMP2, BMP7, כבר שילבו על מנת לשפר את הפוטנציאל osteogenic של לגרדום מסוים2.
כמו קריטריון מהותי, כגון מערכות אספקה פקטורי גדילה צריך לספק שחרור במינון מבוקר לאורך זמן כדי להקל על האירועים חיוניים כמו גיוס תא, קובץ מצורף, ingrowth תא אנגיוגנזה. עם זאת, BMPs כמו גם גורמים אחרים-צמיחה osteogenic היה נפוץ מתאושש הלא-covalently3. מלכודת וטכניקות ספיחה דורשים השימוש בכמות החלבון עקב שחרור פרץ הראשוני, מה שמוביל חסרונות חמור ויוו, בדרך כלל להשפיע על הרקמות הסובבות על ידי גרימת overgrowth העצם, העל-פיזיולוגיים osteolysis, נפיחות ודלקת4. לפיכך, השמירה של גורמי גדילה באתר משלוח עבור תקופות זמן ארוכות יותר יכולה להיות מושגת על ידי שיטות קוולנטיות הנייח. מבחינה כימית שונה BMP2 (succinylated5, acetylated6 -biotinylated7), הנדסה לאחור heterodimers8, או BMP2 oligopeptides נגזר9 מיועד ומשמש כדי להתגבר על המגבלות הקשורות הקליטה. עם זאת, הביו-הפעילות של מבנים אלה אינה צפוי מאז ההסדר פוטנציאל מעכב את הכריכה של ליגנד קיבוע אל קולטנים הסלולר. כמוצג קודם לכן, זה הכרחי כי כל שרשראות קולטן ארבעה מעורבים היווצרות של ליגנד מופעל-קולטן מתחמי אינטראקציה עם BMP2 קיבוע על מנת להפעיל במלואה כל הזרם איתות cascades10.
כדי להתגבר על הבעיות של תוצאה inhomogeneous מוצר עם מגבלות מבחינת אתריים ויציבות הזמינות הביולוגית של הגורם קיבוע, תיכננו variant BMP מסוגל covalently מחייב פיגומים באופן מכוון באתר. וריאנט זה, הנקרא BMP2-K3Plk, כוללת חומצת אמינו מלאכותי, אשר הוצג על ידי הרחבת codon גנטי11. וריאנט זה בהצלחה נקשר פיגומים באמצעות אסטרטגיה צימוד קוולנטיות תוך שמירה על פעילותו הביולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
יצירת חלבון מתויג גרסאות על ידי התרחבות codon גנטית מאפשרת המבוא של תחליפי חומצת אמינו הלא טבעי שונים בעיקר על כל מיקום של רצף החלבון העיקרי. במקרה של BMPs כמו BMP2, משותף מתייג כגון תג 6-היסטידין (שלו) יכול להיות רק הציג N-סופני, כיוון הסוף protein´s C-מסוף קבור בתוך מבנה שלישוני חלבון, ולכן אינו נגיש מב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה ד ר מ’ Rubini (קונסטנץ, גרמניה) מספקים את פלסמיד קידוד pyrrolysyl-tRNA ועל מתן pRSFduet-pyrtRNAsynth קידוד של המעביר aminoacyl-tRNA המתאים.
Materials
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | — | — | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | — | — | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | — | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | — | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3– (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | — | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge – 5417R | Eppendorf | — | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | — | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | — | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler – Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | — | PCR |
| TxRed – microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
