Site yönettiği immobilizasyon kemik morfogenetik protein 2 katı yüzeyler için tıklayın kimya tarafından
Summary
Kemik morfogenetik Protein 2 (BMP2) katkılı Biyomalzeme yeni bir tedavi stratejisi sendikasız Kemik kırıkları iyileşmek için kullanılmaktadır. Yan etkileri faktörü kontrol edilemez bir sürümden kaynaklanan üstesinden gelmek için biz site için yeni bir strateji teklif-doğrudan böylece malzemeleri ile geliştirilmiş Osteojenik yetenekleri oluşturma faktörü, hareketsiz.
Abstract
Uzun kemik defektleri sigara şifa tedavisi için farklı tedavi stratejileri yoğun bir şekilde araştırdık. Tedaviler mevcut Biyomalzeme kemik morfogenetik proteinler (BMP) gibi Osteojenik büyüme faktörleri ile birlikte kullanımı yol açmıştır bazı sınırlamaları kullanılmakta. Yaygın olarak kullanılan emme veya saklama yöntemleri BMP2, genellikle birkaç ciddi olumsuz yan etkileri kışkırtır bir sözde ilk patlama yayın etkisi sonucu supra fizyolojik miktarda gerektirir. Bu sorunların üstesinden gelmek için strateji kovalent protein için iskele çift olacaktır. Ayrıca, bağlantı site belirli bir şekilde bir tekrarlanabilir ürün sonuç sağlamak için yapılmalıdır. Bu nedenle, biz bir yapay amino asit (propargyl-L-lizin) kodon kullanımı genişletme (BMP2-K3Plk) tarafından BMP2 protein olgun parçası tanıtıldı bir BMP2 değişken oluşturdu. BMP2-K3Plk functionalized boncuk bakır katalize azid ALKİN cycloaddition (CuAAC) ile birleştiğinde. Eşleşmiş BMP2 K3Plk biyolojik aktivitesini vitro kanıtlanmış oldu ve BMP2-K3Plk-functionalized boncuk Osteojenik etkinlik tabanlı hücre deneyleri kanıtlanmış oldu. C2C12 hücreleri ile temas functionalized boncuk boncuk yerel olarak kısıtlı bir mesafede alkalen fosfataz (ALP) ifade ikna edebildik. Böylece, bu tekniği ile functionalized iskele üretilebilir hücre farklılaşması Osteojenik bir soy doğru tetikleyebilir. Ayrıca, alt BMP2 dozlarda eşleşmiş BMP2 site yönettiği kontrollü yönelimi nedeniyle yeterlidir. Bu yöntemle, BMP her zaman onların reseptörleri hücre yüzeyi uygun yönde hangi faktörler site yönettiği kaplin teknikleri ile birleştiğinde Eğer durum böyle değil maruz kalır. Ürün sonucu çok kontrol edilebilir ve böylece, malzeme homojen özellikleri, onların uygulanabilirliği kritik boyutu tamiri için iyileştirilmesi ile sonuçlarında kusurları kemik.
Introduction
Kemik doku Mühendisliği ve kemik rejenerasyonu nihai hedefi dezavantajları ve sendikasız kırıklar ortak tedaviler sırasında ortaya çıkan sınırlamalar üstesinden gelmektir. Her ikisi de birkaç dezavantajları olsa bile otomatik veya allo nakillerine ağırlıklı olarak geçerli tedavi stratejileri kullanılır. İdeal kemik grefti osteogenesis osteoindiksiyon yanı sıra osteoconduction, kemik greft osteointegrasyon için lider tarafından ikna etmek. Günümüzde, bir ideal kemik grefti tüm özelliklerinin sağladığı yalnızca otomatik nakli “altın standart” kabul edilir. Ne yazık ki, uzun cerrahi kez ve genellikle daha fazla komplikasyonlar (örneğin, kronik ağrı, Hematom oluşumları, enfeksiyonlar, kozmetik kusurları, vb) gerektirdiği ikinci bir travma site gibi önemli olumsuz yönleri de sunar. Allojenik Greftler, öte yandan tüm genel özellikleri1için suboptimal özelliklere sahip. Alternatif kemik greft teknolojileri osteoindüktif, osteoconductive, Biyouyumlu, ve bioresorbable iskele üretmek amacı ile son birkaç yıl içinde geliştirilmiştir. Birçok Biyomalzeme değil göstermek tüm Osteojenik bu özelliklere göre farklı büyüme faktörleri, özellikle BMP2 ve BMP7, belirli iskele2Osteojenik potansiyelini artırmak için dahil edilmiş.
Önemli bir ölçüt olarak hücre işe alım ve eki, hücre ingrowth ve anjiogenezi gibi önemli olaylar kolaylaştırmak amacıyla bir kontrollü doz yayın zamanla böyle büyüme faktörü vasıtalarının sağlamalıdır. Ancak, bmp gibi diğer Osteojenik büyüme faktörleri de sık kovalent olmayan3immobilize. Tuzak ve adsorpsiyon teknikleri genellikle kemik büyüme inducing tarafından çevre dokular etkileyen şiddetli dezavantajları içinde vivo yol açar bir ilk patlama açıklaması nedeniyle protein supra fizyolojik miktarda kullanımını gerektiren, Osteoliz, şişme ve iltihap4. Böylece, büyüme faktörleri daha uzun süreler için teslim yerinde tutma kovalent immobilizasyon yöntemleri tarafından elde edilebilir. Kimyasal olarak değiştirilmiş BMP2 (succinylated5, acetylated6 veya biotinylated7), mühendislik heterodimers8veya türetilmiş oligopeptides9 tasarlanmış ve sınırlamaları aşmak için kullanılan BMP2 ile ilgili emme. Ancak, düzenleme potansiyel olarak immobilize ligand bağlanması için hücresel reseptörleri inhibe. beri biyo-etkinlik bu yapıları, tahmin edilebilir değildir. Olarak daha önce gösterilen, bu tüm dört reseptör zincirleri aktif ligand-reseptör kompleksleri oluşumunda yer alan tüm aşağı akım sinyal cascades10tam olarak etkinleştirmek için immobilize BMP2 ile etkileşim esastır.
Bir inhomogeneous ürün sonucu sorunları açısından bioactivity, istikrar ve bioavailability immobilize faktörünün kısıtlamaları aşmak için kovalent iskele site yönettiği bir şekilde bağlama yetenekli bir BMP değişken tasarlanmıştır. BMP2-K3Plk, olarak adlandırdığı bu varyant genetik kodon genişleme11‘ de kullanılmaya başlanan yapay bir amino asit oluşur. Bu varyant için iskele süre paraca desteklemek onun biyolojik aktivitesi kovalent kaplin strateji kullanarak başarıyla bağlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tagged protein değişik genetik kodon genişleme getirici birincil protein dizi herhangi bir konumundaki başta olmak üzere çeşitli doğal olmayan amino asit analogları giriş izin verir. 6-histidin (onun) etiketi yalnızca olabilir gibi BMP2 gibi BMP durumunda ortak Etiketler beri protein´s C-terminal sonuna Tersiyer protein yapısı içinde gömülü ve böylece dışarıdan erişilebilir değil N ölümcül, tanıttı. Diğer konumlarda tanıtılan etiket boyutunu çok büyük olasılıkla sonuç olarak BMP´s b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr. M. Rubini (Konstanz, Almanya) pyrrolysyl-tRNA kodlama plazmid sağlamak için ve pRSFduet-pyrtRNAsynth karşılık gelen aminoasil tRNA sentetaz kodlama sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Material | |||
| 1-Step NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Add solution to cells |
| 3-Azido-7-hydroxycoumarin | BaseClick | BCFA-047-1 | Chemical used for click reaction |
| Agarose low melting point | Biozym | 840101 | Agarose for ALP assay |
| Azide agarose beads | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Beads used for reaction |
| BamHI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Restriction enzyme |
| BMP receptor IA (BMPR-IAEC) | — | — | Produced in our lab |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Chemical used for Coomassie Brilliant blue staining of SDS PAGE |
| Copper (II) sulfate anhydrous (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Chemical used for click reaction |
| DNA Polymerase and reaction buffer | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi PCR Kit |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Cell culture media |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Chemical used to stop click reaction |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Bacteria induction (1mM final concentration) |
| NdeI (Fast Digest enzyme) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Restriction enzyme |
| NHS-activated Texas Red | Life technologies | T6134 | Coupled to receptor |
| P- Nitrophenyl Phosphate | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Alkaline Phosphatase |
| p25N-hmBMP2 | — | — | Plasmid kindly provided from Walter Sebald to J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| propargyl-L-lysine (Plk) | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | — | — | Provided by the Chair for Pharmaceutics and Biopharmacy, University Wuerzburg |
| Qiagen Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Gel Purification |
| Qiagen PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR Purification |
| Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Chemical used for click reaction |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligation |
| tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Chemical used for click reaction |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amicon concentrating cell 400 ml | Merck KGaA | UFSC40001 | Concentrating unit |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck KGaA | UFC901024 | Concentrating centrifugal unit |
| ÄKTA avant FPLC | ÄKTA | — | FPLC machine |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrifuge for bacterial culture |
| Bacterial Shaking Incubator | Infors HT | Shaking incubator for bacterial culture | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | — | Imaging and analysis system for SDS-PAGE |
| Fluorescent miscroscope | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3– (M) | Merck KGaA | 116882 | Ion Exchange Chromatography column material |
| Greiner CELLSTAR® 96 well plates | Sigma | M5811-40EA | 96 well plates for cell culture (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | — | Centrifuge |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoScientific | 75003624 | Rotor for Microcentrifuge for plate during ALP staining |
| Microcentrifuge – 5417R | Eppendorf | — | Centrifuge |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | — | software for stastic analysis of ALP assay data |
| Polysine Slides | ThermoScientific | 10143265 | microscope slides |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | — | rotor for Avanti J-26XP centrifuge |
| Tecan infinite M200 multiplate reader | Tecan Deutschland GmbH | — | Multiplate reader for ALP assay |
| Thermocycler – Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | — | PCR |
| TxRed – microscope filter | Keyence | Filter for fluorescent microscope | |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
| Ultrafiltration regenerated cellulose discs 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | used with amicon concentrating cell 400ml |
References
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
- Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
- Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
- Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
- Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
- Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
- Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
- Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
- Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
- Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
- Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
- Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
- Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
- Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
- Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
- Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
- Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
