इस प्रोटोकॉल स्व-इकट्ठा ऊतक एक स्वनिर्धारित 3d-मुद्रित प्लास्टिक मोल्ड का उपयोग कर चर आकार में छल्ले के लिए एक मंच का वर्णन । 3डी-प्रिंटेड मोल्ड में PDMS निगेटिव ठीक हो जाते हैं; फिर agarose ठीक PDMS निगेटिव में डाली जाती है. कोशिकाओं के परिणामस्वरूप agarose कुओं जहां वे ऊतक के छल्ले में समग्र में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं ।
इंजीनियर ऊतकों नैदानिक ऊतक की मरंमत और प्रतिस्थापन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, और दवा स्क्रीनिंग और मानव रोग मॉडलिंग के लिए उपकरणों के रूप में विकसित किया जा रहा है । स्व-इकट्ठे ऊतक पाड़ पर लाभ की पेशकश-आधारित ऊतक इंजीनियरिंग, बढ़ाया मैट्रिक्स जमाव, शक्ति, और समारोह के रूप में । हालांकि, वहां पर या एक सहायक पाड़ के भीतर कोशिकाओं बोने के बिना 3 डी ऊतकों के निर्माण के लिए कुछ उपलब्ध तरीके हैं । इससे पहले, हम गैर-चिपकने वाला agarose कुओं में कोशिकाओं सीडिंग द्वारा स्वयं इकट्ठे ऊतक के छल्ले के निर्माण के लिए एक प्रणाली विकसित की है । एक polydimethylsiloxane (PDMS) नकारात्मक पहले एक मशीनी पाली कार्बोनेट मोल्ड में डाली गई थी, और फिर agarose PDMS नकारात्मक में gelled अंगूठी के आकार का कोशिका बोने के कुओं बनाने के लिए किया गया था । हालांकि, इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा पाली कार्बोनेट मोल्ड मशीन के लिए उपलब्ध उपकरणों के संकल्प द्वारा सीमित था । यहां, हम प्रदर्शित करते है कि 3 डी मुद्रित प्लास्टिक PDMS नकारात्मक गढ़े के लिए मशीनी पाली कार्बोनेट के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । 3d मुद्रित मोल्ड और संशोधित मोल्ड डिजाइन का उपयोग करने के लिए आसान है, उत्पादन करने के लिए सस्ती है, और अच्छी तरह से बोने की सेल प्रति काफी कम agarose और PDMS की आवश्यकता है । हमने दिखा दिया है कि जिसके परिणामस्वरूप agarose कुओं को स्वयं बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, अलग कोशिका प्रकार की एक किस्म से अनुकूलित व्यास के साथ ऊतक के छल्ले इकट्ठे । छल्ले तो यांत्रिक, कार्यात्मक, और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण, या बड़े और अधिक जटिल ट्यूबलर ऊतकों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
सेलुलर स्वयं विधानसभा ऊतक इंजीनियर रक्त वाहिकाओं के निर्माण के लिए दृष्टिकोण पाड़ के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण आधारित हैं । स्व इकट्ठे, पाड़-मुक्त ऊतकों अधिक से अधिक सेल घनत्व, बढ़ाया मैट्रिक्स जमाव और शक्ति हो सकता है, और बेहतर जैविक समारोह पाड़ आधारित ऊतकों की तुलना में1,2,3,4 . हालांकि, विशिष्ट आकार और आकार के साथ exogenous पाड़ समर्थन के उपयोग के बिना 3 डी ऊतकों के गठन एक चुनौती बनी हुई है । कुछ तरीकों को एक साथ सेल शीट की परतों फ्यूज को मोटा निर्माण फार्म, हालांकि इस प्रक्रिया को समय लगता है और श्रम गहन5हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को गैर चिपकने वाले मोल्ड में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और spheroids, अंगूठियां, और अंय ऊतक आकार6,7,8में समग्र करने की अनुमति दी ।
स्व-इकट्ठे ऊतक के छल्ले कम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, कम संस्कृति बार, और बड़ा ट्यूबलर इंजीनियर ऊतकों की तुलना में कम रिएजेंट, लेकिन अभी भी यांत्रिक परीक्षण किया जा सकता है, histologically की जांच, या सिकुड़ना और अंय कार्यात्मक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया7 , 9 , 10 , 11. क्योंकि वे तेजी से गढ़े और आसानी से परीक्षण किया जा सकता है, ऊतक के छल्ले संस्कृति मापदंडों की बड़ी संख्या स्क्रीनिंग के लिए आदर्श होते हैं, और रोग मॉडल11 या दवा स्क्रीनिंग12के लिए उपकरण के रूप में उपयोग के लिए संभावित है । इसके अतिरिक्त, छल्ले रक्त वाहिकाओं या श्वासनली7,13के रूप में और अधिक जटिल ऊतक संरचनाओं में इनकार किया जा सकता है, और छल्ले spheroids14,15जैसे अंय आकृतियों की तुलना में अधिक पूरी तरह से फ्यूज कर सकते हैं ।
Agarose व्यापक रूप से स्व-इकट्ठे अपनी असंगति, पारगम्यता, और गैर-कोशिका चिपकने वाले गुणों के कारण ऊतकों के निर्माण के लिए एक सांचे में ढालना सामग्री के रूप में प्रयोग किया जाता है । उदाहरण के लिए, Norotte एट अल. गढ़े agarose molds से बाहर निकाला छड़, जो मोल्ड आकार और आवश्यक विशेष उपकरण15पर सीमित नियंत्रण सक्षम होना चाहिए । टैन एट अल. विभिंन आकार (पिरामिड, स्क्वायर)16में कस्टम hydrogel molds बनाना करने के लिए निर्माण इकाइयों के रूप में जमा alginate बूंदें । हालांकि, alginate spheroids (300 µm) के बड़े व्यास कम संकल्प के साथ सुविधाओं के परिणामस्वरूप । ऐसा कम रिज़ॉल्यूशन असमान मोल्ड सतहों में परिणाम दे सकता है जो कोशिका एकत्रीकरण संगति को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, agarose बहुलक नकारात्मक में चिकनी सुविधाओं और विशिष्ट आयाम6,7,17के साथ गैर चिपकने वाला molds बनाने के लिए डाली जा सकता है ।
हम पहले कस्टम कुंडलाकार agarose सेल के निर्माण के लिए एक प्रणाली की सूचना दी एक PDMS नकारात्मक डाली से कुओं बोने की एक चक्की पाली कार्बोनेट मोल्ड में7,18। Agarose PDMS नकारात्मक में डाल दिया गया था और7,18सेट करने की अनुमति दी । कोशिकाओं को तो agarose वेल्स, जहां वे स्वयं के रूप में इकट्ठे, पाड़-मुक्त ऊतक 24 ज7,18से कम समय में छल्ले में वरीयता प्राप्त थे । PDMS नकारात्मक autoclavable हैं, कई बार reused किया जा सकता है, और नरम और लचीला कर रहे हैं, यह आसान जम agarose कुओं को दूर करने के लिए बना । जब इस सिस्टम को शुरू में Gwyther एट अल में रिपोर्ट किया गया था । 7, PDMS नकारात्मक (चित्रा 1a) milled पॉली मोल्ड्स से डाली गई । agarose कास्टिंग के बाद, सेल बीज वाले कुओं व्यक्तिगत रूप से काट रहे थे और एक 12 अच्छी प्लेट7,18के कुओं में रखा । डिजाइन और हाल ही में इस तरह के संशोधित किया गया था कि एक एकल agarose मोल्ड 5 के छल्ले का उत्पादन और एक कुआं में फिट बैठता है एक 6-अच्छी तरह से प्लेट, बाहर व्यक्तिगत कुओं में कटौती और PDMS और agarose की मात्रा को कम करने की आवश्यकता को नष्ट करने के लिए प्रत्येक अंगूठी (चित्र 1b) का उत्पादन । एक छोटे कोशिका बोने की गर्त चौड़ाई के लिए अंगूठी गठन को प्राप्त करने के लिए आवश्यक बीज वाले कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन परिवर्तनों के बावजूद, संकल्प और मोल्ड के अनुकूलन उपलब्ध मानक endmill आयामों को प्रतिबंधित किया गया है, और micromilling नकारात्मक स्तर तक महंगा हो सकता है । इसके अतिरिक्त, कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण (सीएनसी) मशीनिंग समय लेने और बोझिल भारी उपयोग कस्टम उपकरणों पर समय आरक्षित करने की आवश्यकता के कारण हो सकता है, अतिरिक्त कंप्यूटर सहायता प्राप्त विनिर्माण (सांचा) सॉफ्टवेयर को कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन कंवर्ट ( सीएडी) एक प्रोग्राम उपकरण पथ के लिए फ़ाइल, और मशीनिंग के दौरान पाली कार्बोनेट भाग के विश्वसनीय fixturing ।
वर्तमान अध्ययन में, हम सीएनसी मशीनिंग के लिए एक विकल्प के रूप में 3 डी मुद्रण के उपयोग की जांच की । 3 डी मुद्रण व्यापक रूप से इंजीनियरिंग कस्टम प्रत्यारोपण के लिए प्रयोग किया जाता है, पाड़ सामग्री बनाना, और कोशिकाओं और ऊतक spheroids के प्रत्यक्ष मुद्रण के लिए15,19,20। हम एक उच्च संकल्प 3 डी प्रिंटर का इस्तेमाल किया, और विशेष 3 डी मुद्रण सामग्री है कि हमें एक चिकनी, चमकदार सतह खत्म ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक कठोर मोल्ड मुद्रित करने के लिए सक्षम होना चाहिए । हमारी तकनीक अत्यधिक अनुकूलन, उच्च संकल्प प्लास्टिक molds कि कास्टिंग PDMS नकारात्मक और agarose कुओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के निर्माण के लिए अनुमति देता है । डिज़ाइन पुनरावृत्तियां चित्र 1में सारांशित की जाती हैं । मोल्ड डिजाइन और 3 डी-मुद्रित मोल्ड संस्करण में संशोधित किया गया था पतला बाहरी दीवारों और एक केंद्र छेद में शामिल करने के क्रम में 3 डी-मुद्रित molds और PDMS नकारात्मक से agarose कुओं से दोनों PDMS नकारात्मक के हटाने को कम करने के लिए । इन पतला सुविधाओं मानक मशीनिंग प्रक्रियाओं के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है । कुओं के नीचे से मोल्ड के नीचे की दूरी इस चलना में वृद्धि हुई थी, पदों के नीचे एक मोटा agarose आधार में agarose अच्छी तरह से हटाने के दौरान तोड़ने के पदों के जोखिम को कम करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप । मोल्ड और अंगूठी निर्माण प्रक्रिया योजनाबद्ध रूप से चित्रा 2में दिखाया गया है ।
यहां हम स्वयं के तेजी से निर्माण के लिए एक बहुमुखी विधि प्रस्तुत किया है, आसानी से अनुकूलित 3 डी मुद्रण का उपयोग आयामों के साथ इकट्ठा ऊतक के छल्ले । हमारा तरीका है कि Svoronos एट अलमें सूचना के समान है । ६ , जहां 3d मुद्रित छत्ते और कुत्ते की हड्डी के आकार का मोम मोल्ड PDMS नकारात्मक कास्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया । हालांकि, कई अद्वितीय डिज़ाइन सुविधाओं को शामिल करने के लिए मोल्ड्स को संशोधित किया गया है । एक पायदान (चित्र 4a(1)) मोल्ड के अभिविंयास प्रदान करता है प्रत्येक अंगूठी को लेबल और व्यक्तिगत रूप से निगरानी की अनुमति देते हैं । सेंट्रल होल (चित्रा 4a(2)) कुओं में मध्यम के प्रसार में सुधार में मदद करता है. सीएडी फ़ाइल संख्या सीधे मोल्ड पर मुद्रित कर रहे हैं; इसलिए, PDMS नकारात्मक प्रत्येक संस्करण संख्या और पोस्ट व्यास के साथ लेबल (चित्रा 4A3) हैं । पतला बाहरी दीवारों (चित्रा 3(1), 5 °), अच्छी तरह से गर्त के शीर्ष पर (चित्रा 3(2), 45 °), और सेंट्रल होल (चित्रा 3(3), 5 °) 3 डी-प्रिंटेड मोल्ड्स से PDMS निगेटिव को दूर करना आसान बनाएं , और agarose कुओं को PDMS नकारात्मक (चित्र 4a(2), एक (4)) से निकालने के लिए आसान कर रहे हैं ।
हमने इस प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन किया है, जिसमें प्राथमिक मानव चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMCs)18,22, चूहे महाधमनी SMCs7 सहित व्यास और कोशिका प्रकार की विभिन्न प्रकार के ऊतकों के आकार के ऊतक इकट्ठे किए गए हैं । , 23, मानव mesenchymal स्टेम सेल (hMSCs)13, और SMCs प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से व्युत्पंन (iPSCs)11 (तालिका 1) । चल रहे काम में, हम ऐसे endothelial कोशिकाओं के रूप में अतिरिक्त सेल प्रकार से छल्ले के गठन का मूल्यांकन कर रहे हैं, और सांस प्रतिस्थापन में संभावित अनुप्रयोगों के लिए अलग आकार के उपास्थि छल्ले से इनकार । पूरी तरह से सेल व्युत्पंन निर्माण के अलावा, हम भी इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है शामिल पार से जुड़ा हुआ जिलेटिन microspheres13,22के साथ छल्ले बनाना । Microspheres के दौरान ऊतक के छल्ले के भीतर शामिल किया जा सकता है स्वयं विधानसभा के दौरान अतिरिक्त यांत्रिक शक्ति प्रदान करने के लिए, या विकास कारकों के स्थानीयकृत प्रसव के लिए13,22।
जब ऊतक के छल्ले गढ़े, सेल संख्या का अनुकूलन विभिंन प्रकार के सेल के लिए आवश्यक हो सकता है । कक्षों के आकार और प्रकार के आधार पर ंयूनतम कक्ष संख्याएं भिंन हो सकती हैं । उदाहरण के लिए, iPSCs से व्युत्पंन hSMCs ६००,००० कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त कर रहे है/अंगूठी11, hMSCs और प्राथमिक hSMCs गल्ले कोशिकाओं/अंगूठी13,22, और चूहे महाधमनी SMCs में बीज के लिए कर रहे है 500,000/ गर्त आयाम भी अंगूठी गठन और अंगूठी गठन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की ंयूनतम संख्या24प्रभावित हो सकता है । मानव कोशिकाओं और 3d-मुद्रित मोल्ड के साथ अध्ययन के लिए, 2 मिमी के गर्त चौड़ाई का इस्तेमाल किया गया था । मूल पाली कार्बोनेट मोल्ड 3.75 mm, जो ७५०,००० hSMCs की आवश्यकता के गर्त चौड़ाई था एक 2 मिमी सेल की अंगूठी18फार्म । कम गर्त चौड़ाई के साथ, हम को 46% से अंगूठी गठन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या को कम करने में सक्षम थे, अंगूठी25प्रति गल्ले कोशिकाओं के लिए । प्रति रिंग वरीयता प्राप्त कक्षों की मात्रा तालिका 1में सारांशित की जाती है ।
जब एक 3d मुद्रित सामग्री का चयन, कई कारकों पर विचार करने की आवश्यकता है । क्योंकि PDMS आम तौर पर 60 डिग्री सेल्सियस पर ठीक हो जाता है, 3d-मुद्रित सामग्री PDMS इलाज के दौरान क्षति से बचने के लिए एक उच्च पर्याप्त पिघलने तापमान होना चाहिए । इस अध्ययन में प्रयुक्त सामग्री के पिघलने तापमान (एक मालिकाना सामग्री, सामग्री की तालिकादेखें) उपलब्ध नहीं है । हालांकि, जब 1 घंटे के लिए 60 ° c पर बेक किया हुआ, हम सामग्री एक गंध का उत्पादन करने के लिए शुरू हुआ कि मनाया । इस प्रकार, हम 50 डिग्री सेल्सियस के लिए इलाज के तापमान को कम करने और 3 डी मुद्रित सामग्री को नुकसान पहुंचाए बिना PDMS सेंकना करने के लिए इलाज के समय में वृद्धि करने का फैसला किया । अगर molds बड़ा PDMS नकारात्मक फार्म के लिए संशोधित कर रहे है इलाज के समय में समायोजन आवश्यक हो सकता है । 3 डी-मुद्रित molds से PDMS हटाने के बाद 60 ° c पर एक अतिरिक्त इलाज की अवधि शेष चिपचिपा से अंतिम PDMS नकारात्मक रोकता है, जबकि तापमान 3 डी-मुद्रित मोल्ड को उजागर है सीमित । ध्यान दें कि कुछ सामग्री PDMS के इलाज को बाधित है, तो सुनिश्चित करें कि चयनित सामग्री PDMS के साथ संगत है । अंत में, मोल्ड सामग्री विषाक्तता पर भी विचार किया जाना चाहिए । जबकि 3 डी-मुद्रित मोल्ड कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में नहीं होगा, यह संभव है कि मोल्ड से कुछ अवशेषों इलाज प्रक्रिया के दौरान PDMS नकारात्मक को हस्तांतरित किया जा सकता है । हमने पाया है कि बहुत पूरी तरह से डिटर्जेंट के साथ धोने के लिए PDMS नकारात्मक से किसी भी अवशेषों को दूर पर्याप्त था । हालांकि, हमने पहले देखा है कि अपर्याप्त धोने agarose कुओं में गरीब अंगूठी गठन के लिए नेतृत्व में पहले कुछ का उपयोग करता है के लिए नकारात्मक PDMS । अंय 3d-मुद्रित सामग्री से PDMS कास्ट का उपयोग अतिरिक्त जांच की आवश्यकता को सत्यापित करने के लिए कि डिटर्जेंट मोल्ड अवशेषों को हटाने के लिए पर्याप्त है, किसी भी संभावित leachates सहित हो सकता है । आवधिक परीक्षण भी आवश्यक हो सकता है, के रूप में यह संभव है कि दोहराया हीटिंग चक्र (यहां तक कि 50 डिग्री सेल्सियस) मोल्ड नुकसान हो सकता है समय के साथ, और कारण के अवशेषों में दोहराया उपयोग के बाद बढ़ जाती है । तारीख करने के लिए, हम एक एकल 3d मुद्रित मोल्ड का उपयोग किया है अधिक से अधिक 30 PDMS नकारात्मक है कि सफलतापूर्वक ऊतक के छल्ले उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है उपज ।
कुल मिलाकर, 3 डी मुद्रण पाली की मशीनिंग से agarose molds के निर्माण के लिए अधिक से अधिक बहुमुखी प्रतिभा की अनुमति देता है । यह टूलींग के साथ संभव है की तुलना में एक उच्च संकल्प प्रदान करता है, और मोल्ड डिजाइन उपलब्ध उपकरणों के आयामों द्वारा सीमित नहीं है । यह अधिक से अधिक अनुकूलन के लिए अनुमति देता है, और ऐसे पतला है कि मशीनिंग के साथ संभव नहीं हो सकता है के रूप में सुविधाओं के अलावा । इस प्रणाली के रूप में अच्छी तरह से अंय आकार में आत्म इकट्ठे ऊतकों, के छल्ले के अलावा6,17के निर्माण के लिए लागू किया जा सकता है । अंगूठी निर्माण विधि का प्रयोग, हम सेल प्रकार और आकार की एक किस्म से सांस ऊतक इंजीनियरिंग में संभावित अनुप्रयोगों के लिए ऊतक के छल्ले विकसित किया है13, इंजीनियर रक्त वाहिकाओं7, और मॉडलिंग संवहनी रोगों11.
The authors have nothing to disclose.
हम आभार डॉ एरिका Stults (अकादमिक अनुसंधान और आवेदन वैज्ञानिक, WPI सूचना प्रौद्योगिकी सेवाओं) 3d प्रिंटिंग, Amanda Zoë Reidinger, पीएच. डी., क्रिस Nycz, और करेन लेवी, एमई के साथ उसकी सहायता के लिए स्वीकार करते हैं, मोल्ड डिजाइन पर अपने इनपुट के लिए, कैथी Suqui और जेनिफर मान उनकी सहायता परीक्षण मोल्ड डिजाइन के लिए, और माइकल O’Keefe फिल्माने के साथ उनकी सहायता के लिए । यह काम NSF IGERT डीजीई ११४४८०४ (MWR, has), NIH R15 HL097332 (MWR, टः), NSF रीउ EEC0754996 (बा), NIH 1R01 EB023907 (MWR, has) और NIH R15 HL137197 (MWR, has) द्वारा समर्थित किया गया ।
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50040 | |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
VeroWhite | StrataSys | RGD835 | |
3D printer | StrataSys | Objet 260 Connex | |
DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
FBS | Thermo Fisher | 16000069 | |
L-glutamine | Corning Cellgro | 25-015-CI | |
Non-essential amino acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
Sodium pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
Pen-strep | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells | Provided by T. Wight [ref 21] | N/A |