Denne protokollen beskriver en plattform for fabrikere selv montert vev ringer i varierende størrelser ved hjelp av en tilpasset 3D-trykt plast mold. PDMS negativer er kurert i 3D-trykt mold; deretter er agarose støpt i herdet PDMS negativer. Celler er sådd i de resulterende agarose brønnene hvor de samlet i vev ringer.
Foretatt vev brukes klinisk for tissue reparasjon og utskifting og utvikles som verktøy for menneskelig sykdom modellering og narkotikarelaterte screening. Selv montert vev tilbyr fordeler over stillaset-baserte vev utvikling, som forbedret matrix deponering, styrke og funksjon. Men er det noen metoder for fabrikasjon 3D vev uten seeding celler på eller innenfor en støtte scaffold. Tidligere utviklet vi et system for fabrikere selv montert vev ringer av seeding celler i ikke-klebende agarose brønner. En polydimethylsiloxane (PDMS) negative ble først kastet i en maskinert polykarbonat mold, og deretter agarose var gelled i PDMS negative opprette ringformede celle seeding brønner. Men var allsidigheten av denne tilnærmingen begrenset av oppløsningen av verktøy tilgjengelig for maskinering polykarbonat mold. Her viser vi at 3D-trykt plast kan brukes som et alternativ til maskinert polykarbonat for fabrikasjon PDMS negativer. 3D-trykt mold og revidert mold design er enklere å bruke, billig å produsere, og krever betydelig mindre agarose og PDMS per celle seeding godt. Vi har vist at de resulterende agarose brønnene kan brukes å opprette selv montert vev ringer med tilpassede diameter fra en rekke forskjellige celletyper. Ringer kan deretter brukes for mekanisk, funksjonelle og histologiske eller fabrikere større og mer komplekse rørformede vev.
Mobilnettet selvtillit forsamlingen tilnærminger til fabrikasjon vev utvikling blodkar er et alternativ til stillaset tilnærminger. Selv samlet, stillas-fri vev kan ha større celle tetthet, forbedret matrix avsettelse og styrke og forbedret biologisk funksjon i forhold til stillaset-baserte vev1,2,3,4 . Imidlertid danner 3D vev uten bruk av eksogene stillaset støtte med bestemte størrelser og former er fortsatt en utfordring. Noen metoder smelter sammen lag celle ark til tykkere konstruerer, selv om denne prosessen kan være tidkrevende og arbeidskraft intensiv5. Eventuelt cellene kan seeded i ikke-klebende former og tillatt å samlet i spheroids, ringer og andre vev figurene6,7,8.
Selv montert vev ringene krever færre celler, kortere kultur tider og mindre reagenser enn større rørformede konstruert vev, men kan fortsatt være mekanisk testet, undersøkt histologisk eller contractility og andre funksjonelle tester7 , 9 , 10 , 11. fordi de kan fremstille raskt og enkelt testet, vev ringer er ideelle for screening stort antall kultur parametere, og har potensial som sykdom modeller11 eller verktøy for narkotikarelaterte screening12. Dessuten ringer kan være smeltet sammen til mer komplekse vev strukturer som blodkar eller spor7,13, og ringer kan sikring mer fullstendig enn andre figurer som spheroids14,15.
Agarose er mye brukt som mold materiale for fabrikere selv montert vev sin biocompatibility, permeabilitet og ikke-klebende egenskaper. For eksempel fremstille Norotte et al. agarose former fra ekstrudert stenger, som aktivert begrenset kontroll over mold form og nødvendige spesialisert utstyr15. Tan et al. avsatt alginate dråper som bygge enheter å utvikle egendefinerte hydrogel former i ulike figurer (pyramide, square)16. Men resulterte stor diameter på alginate spheroids (300 µm) i funksjoner med lav oppløsning. Så lav oppløsning kan føre til ujevn mold overflater som kan påvirke celle aggregering konsistens. Alternativt kan agarose brukes i polymer negativer opprette ikke-klebende former med glatte funksjoner og bestemte dimensjoner6,7,17.
Vi har tidligere rapportert et system for fabrikasjon egendefinerte Ringformet agarose celle-såing brønner fra en PDMS negative kastet i en valset polykarbonat mold7,18. Agarose ble helles i PDMS negative og lov å sette7,18. Celler var så frø i agarose brønner, hvor de akkumuleres skjemaet selv samlet stillaset-fri vev ringer på mindre enn 24 h7,18. PDMS negativer er autoclavable, kan gjenbrukes mange ganger, og er myk og fleksibel slik at det blir enkelt å fjerne befestet agarose brønnene. Når dette systemet ble opprinnelig rapportert i Gwyther et al. 7, PDMS negativer ble kastet fra valset polykarbonat muggsopp (figur 1A). Etter agarose avstøpning, ble celle seeding brønnene individuelt kuttet ut og plassert i brønner en 12-vel plate7,18. Utformingen ble nylig endret slik at en enkelt agarose mold produserer 5 ringer og passer i en godt av en 6-vel plate, eliminerer behovet å kutte ut individuelle brønner og redusere mengden av PDMS og agarose kreves for å produsere hver ring (figur 1B). En mindre celle seeding gjennom bredde ble brukt til å redusere antall frø celler kreves for å oppnå ring formasjon. Til tross for disse endringene, oppløsning og tilpasning av muggsopp var begrenset til tilgjengelige standard endmill dimensjoner og micromilling kan være uoverkommelig dyrt. I tillegg datamaskinen numerisk kontroll (CNC) maskinering kan være tidkrevende og tungvint på grunn av behovet for å reservere tid på utnyttet sterkt egendefinerte utstyr, ytterligere datamaskinassistert produksjon (CAM) programvare for å konvertere dataassistert konstruksjon ( CAD) filen til en programmerbar verktøyet bane, og pålitelig Fikstureringssystem av polykarbonat under maskinering.
I studien undersøkte vi bruk av 3D-utskrift som et alternativ til CNC maskinering. 3D-utskrift er mye brukt for engineering egendefinerte implantater, fabrikasjon stillaset materialer, og direkte utskrift av celler og vev spheroids15,19,20. Vi brukte en høyoppløselig 3D skriver, og spesialiserte 3D utskrift materiale som mulig for oss å skrive ut en rigid mold med en glatt, glanset overflate finish (se Tabell for materiale). Våre teknikken kan fabrikasjon av tilpasses, høy oppløsning plast former som kan brukes til støping PDMS negativer og agarose brønner. Design iterasjoner oppsummeres i figur 1. Mold design ble ytterligere endret i 3D-trykt mold versjon inkludere konisk yttervegger og en senterhullet for å lette fjerning av begge PDMS negativer fra 3D-trykt formene og agarose brønner fra PDMS negativer. Funksjonene konisk kan ikke oppnås med standard maskinering processes. Avstanden fra bunnen av brønnene til bunnen av mold økt i denne gjentakelse, noe som resulterer i en tykkere agarose base under innlegg å redusere risikoen for innlegg bryte under agarose godt fjerning. Mold og ring fabrikasjon prosedyren er vist skjematisk i figur 2.
Her har vi presentert en allsidig metode for rask fabrikasjon av selv montert vev ringer med lett tilpasses dimensjoner med 3D-utskrift. Vår metode er lik som i Svoronos et al. 6 , der 3D-trykt honeycomb og hunden-Ben formet voks former ble brukt til å kaste PDMS negativer. Imidlertid er formene endret for å inneholde flere unike designelementer. Et hakk (figur 4A(1)) gir retning av mold tillate hver ring merket og overvåket individuelt. Den sentrale hullet (figur 4A(2)) forbedrer spredningen av medium i brønnene. CAD filnumre skrives ut direkte på formen; Derfor PDMS negativer hver merket med versjonsnummeret og legge diameter (Figur 4A3). Konisk ytterveggene (Figur 3(1), 5 °) på toppen av godt trau (Figur 3(2), 45 °) og sentrale hullet (Figur 3(3)5 °) gjør det enklere å fjerne PDMS negativer fra 3D-trykt formene , og agarose brønner er enklere å fjerne fra PDMS negative (figur 4A(2), A(4)).
Vi har vist allsidigheten til dette systemet ved å fabrikere selv montert ringformede vev av en rekke diametere og celletyper, inkludert primære menneskelige glatt muskel celler (SMCs)18,22, rotte aorta SMCs7 , 23og menneskelige mesenchymal stamceller (hMSCs)13SMCs avledet fra indusert pluripotent stamceller (iPSCs)11 (tabell 1). I pågående arbeid, er vi evaluere dannelsen av ringer fra flere celletyper som endotelceller, og blander brusk ringer av varierende størrelse for potensielle programmer i tracheal erstatning. I tillegg til helt celle-avledet konstruerer, har vi også brukt dette systemet for å dikte ringer med innarbeidet krysskoblet gelatin mikrosfærer13,22. Mikrosfærer kan innlemmes i vev ringer under selvtillit forsamlingen for å gi ekstra mekanisk styrke, eller for lokaliserte levering av vekstfaktorer13,22.
Når fabrikere vev ringer, kan optimalisering av celle nummer være nødvendig for forskjellige celletyper. Minimum celle tall kan variere basert på størrelse og type celler. For eksempel hSMCs fra iPSCs er seeded på 600.000 celler/ring11, hMSCs og primære hSMCs er seeded på 400 000 celler/ring13,22og rotten aorta SMCs er seeded 500.000 celler/ring18. Gjennom dimensjoner kan også påvirke ring dannelse og minimum antall celler kreves for ring formasjon24. For studier med menneskelige celler og 3D-trykt muggsopp brukte en gjennom bredde på 2 mm. Den opprinnelige polykarbon formene hadde en gjennom bredde på 3.75 mm, som krevde 750.000 hSMCs danner en 2 mm celle ring18. Med redusert gjennom bredde kunne vi redusere antall celler nødvendig for ring dannelsen av 46% til 400 000 celler per ring25. Antall celler seeded per ring oppsummeres i tabell 1.
Når du velger et 3D-trykt materiale, må mange faktorer vurderes. Fordi PDMS er vanligvis helbredet ved 60 ° C, 3D-trykt materiale må ha høy nok smelter temperatur for å unngå skade ved PDMS herding. Smeltetemperaturen for materialet som brukes i denne studien (en proprietær materiale, se Tabellen for materiale) er ikke tilgjengelig. Men når bakt på 60 ° C i 1 time, observerte vi at materialet begynte å produsere en lukt. Derfor besluttet vi å senke herding temperaturen til 50 ° C og øke herding for å bake PDMS uten å skade den 3D-trykt materialet. Justeringer i herding tid kan være nødvendig hvis muggsopp endres til skjemaet større PDMS negativer. En ekstra herding periode på 60 ° C etter PDMS fjerning fra 3D-trykt formene forhindrer at den endelige PDMS negative gjenværende tacky, samtidig som temperaturen 3D-trykt mold er utsatt. Merk at noen materialer hemme herding av PDMS, slik at at valgte materialet er kompatibel med PDMS. Til slutt må også mold materiale toksisitet vurderes. Mens 3D-trykt mold ikke vil være i direkte kontakt med celler, er det mulig at noen rester fra formen kan overføres til PDMS negative under herding prosedyren. Vi fant at veldig grundig vask med vaskemiddel var tilstrekkelig til å fjerne eventuelle rester fra PDMS negativ. Men observert vi tidligere at utilstrekkelig vask ledet dårlig ring-formasjonen i agarose brønner for første få bruk av PDMS negativ. Bruk av PDMS kastet av andre 3D-trykte materialer krever videre undersøkelser kan kontrollere vaskemiddel er tilstrekkelig å fjerne mold rester, inkludert noen potensielle leachates. Periodiske tester kan også være nødvendig, det mulig at gjentatt oppvarming sykluser (til 50 ° C) kan skade mold over tid, og forårsake øker i rester etter gjentatt bruk. Hittil har vi brukt en enkel 3D-trykt mold for å produsere mer enn 30 PDMS negative som har blitt brukt for å kunne generere vev ringer.
Samlet, 3D utskrift gir større fleksibilitet til fabrikasjon av agarose former enn bearbeiding av polykarbonat. Det gir høyere oppløsning enn det er mulig med verktøy, og mold design er ikke begrenset av dimensjoner av verktøyene. Dette gir større tilpasningsmuligheter, og tillegg av funksjoner som avsmalnende som kan maskinering. Dette systemet kan brukes å fabrikere selv montert vev i andre figurer, i tillegg til ringer6,17. Med metoden ring fabrikasjon har vi utviklet vev ringer fra en rekke celletyper og størrelser for potensielle anvendelser i tracheal tissue engineering13, utviklet blodkar7og modellering vascular sykdommer11.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner takknemlig Dr. Erica Stults (akademisk forskning og søknad vitenskapsmann, WPI IT-tjenester) for henne hjelp med 3D utskrift, Amanda Zoë Reidinger, Ph.D., Chris Nycz og Karen Levi, M.E., for innspill deres på mold design, Kathy Suqui og Jennifer Mann for deres hjelp testing mold design, og Michael O’Keefe for hans hjelp med filming. Dette arbeidet ble støttet av NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, har), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH) NSF REU EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, har) og NIH R15 HL137197 (MWR, har).
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50040 | |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
VeroWhite | StrataSys | RGD835 | |
3D printer | StrataSys | Objet 260 Connex | |
DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
FBS | Thermo Fisher | 16000069 | |
L-glutamine | Corning Cellgro | 25-015-CI | |
Non-essential amino acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
Sodium pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
Pen-strep | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells | Provided by T. Wight [ref 21] | N/A |