Snelle detectie van neurologische fenotypen in menselijke neurale voorlopercellen (NPC)
Summary
Neurologische processen zoals proliferatie, migratie en neurite uitvloeisel zijn vaak verstoord in neuropsychiatrische ziekten. Dus presenteren we protocollen om te snel en reproducibly beoordelen deze neurologische processen in menselijke iPSC afkomstige NPC’s. Deze protocollen toestaan ook de beoordeling van de gevolgen van relevante factoren die de groei en therapeutics NPC ontwikkelingssamenwerking.
Abstract
Ontwikkeling van de menselijke hersenen verloopt door middel van een reeks van precies georkestreerde processen, met eerdere fasen onderscheiden door proliferatie, migratie en neurite de uitgroei; en latere stadia gekenmerkt door axon/dendriet uitgroei en synapse formatie. In neurologische aandoeningen, worden vaak één of meerdere van deze processen verstoord, wat leidt tot afwijkingen in de hersenen vorming en functie. Met de komst van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) technologie hebben de onderzoekers nu een overvloedig aanbod van menselijke cellen die kunnen worden onderscheiden in vrijwel elk celtype, met inbegrip van neuronen. Deze cellen kunnen worden gebruikt om te studeren zowel normale hersenontwikkeling en pathogenese van de ziekte. Een aantal protocollen met behulp van hiPSCs te modelleren neuropsychiatrische ziekte gebruik terminaal gedifferentieerde neuronen of gebruik 3D cultuur systemen organoids genoemd. Hoewel deze methoden hebben bewezen onschatbare waarde bij het bestuderen van de pathogenese van de ziekte bij de mens, zijn er sommige nadelen. Differentiatie van hiPSCs in neuronen en generatie van organoids zijn langdurige en kostbare processen die van invloed kunnen het aantal experimenten en variabelen die kunnen worden beoordeeld. Bovendien, terwijl na mitotische neuronen en organoids toestaan de studie van ziekte verband houdende processen, waaronder dendriet uitgroei en synaptogenese, zij weg dat de studie van eerdere processen zoals proliferatie en migratie. In neurologische aandoeningen, zoals autisme, blijkt overvloedige genetische en na het slachten gebreken in de vroege ontwikkelings processen. Neurale voorlopercellen (NPC), een zeer proliferatieve celpopulatie, mogelijk een geschikt model waarin vragen te stellen over de ontogenetische processen en tijdens het initiëren van de ziekte. We breiden nu methodologieën geleerd van het bestuderen van de ontwikkeling in muis en rat corticale culturen aan menselijke NPC’s. Het gebruik van NPC’s kan we ziekte verband houdende fenotypen onderzoeken en definiëren hoe verschillende variabelen (bijvoorbeeld, groeifactoren, drugs) effect developmental processen zoals proliferatie, migratie en differentiatie in slechts een paar dagen. Uiteindelijk, kan deze toolset reproduceerbaar en high-throughput wijze worden gebruikt om ziekte-specifieke mechanismen en fenotypen in neurologische aandoeningen te identificeren.
Introduction
Het gebruik van eenvoudiger organismen en Muismodellen heeft toegelicht de mechanismen van fundamentele hersenontwikkeling, alsmede de pathogenese van de ziekte. Ondanks deze vooruitgang blijft de etiologie van vele neuropsychiatrische aandoeningen ongrijpbaar omdat niet alle bevindingen in eenvoudiger organismen direct relevant voor complexe aspecten van ziekten bij de mens zijn. Verder, de grotere complexiteit van het menselijk brein vaak maakt het moeilijk om de menselijke ontwikkeling model en aandoeningen bij dieren. Met de evolutie en de vooruitgang van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) technologie, kunnen somatische cellen worden geherprogrammeerd tot stamcellen en vervolgens gedifferentieerd in neuronale cellen om te studeren ziekten bij de mens. Vooruitgang in de hiPSCs en “dienst” technologieën (transcriptomics, genomica, proteomica, metabolomica) beloven om een ommekeer teweeg op het begrip van de ontwikkeling van de menselijke hersenen. Deze technologieën nu maken mogelijk een “precisie geneeskunde”-benadering aan de karakterisatie van neuropsychiatrische ziekten op een case-by-case basis.
De huidige nietje in het veld hiPSC ziekte-modeling is om te onderscheiden van cellen in specifieke neuronale subtypen in een enkelgelaagde of gebruiken van een 3D-cultuur-systeem, genaamd een organoid om te recapituleren aspecten van hersenen ontwikkeling1,2, 3. Deze systemen zijn ongelooflijk waardevol in studeren en unieke aspecten van menselijke ontwikkeling en ziekte4,,5,,6,7blootleggen. Echter vereisen zowel neuronale culturen en organoids vaak overal van weken tot maanden in cultuur voordat ze klaar om te bestuderen zijn. De tijdrovende aard van deze protocollen en het bedrag van de middelen die nodig zijn om dat deze systemen cultuur vaak beperken het aantal experimenten die kunnen worden uitgevoerd en het aantal variabelen (zoals groeifactoren of drugs) die kan worden getest. Bovendien hebben vele studies met behulp van post mitotische neuronen en organoids gericht op processen zoals dendriet uitgroei of synaps formatie, die later in ontwikkeling te voorkomen. Terwijl deze processen zijn betrokken bij de pathologie van ontwikkelingsstoornissen zoals autisme en schizofrenie, zijn eerder developmental gebeurtenissen die voordat definitieve neuronale differentiatie plaatsvinden ook belangrijk voor de pathogenese van de ziekte8 ,9,10,11,12,13. Inderdaad, recente genomic studies tonen aan dat de medio-foetale periode, die uit de proliferatie, proces uitgroei en migratie bestaat, met name belangrijk in autisme pathogenese11,14 is. Het is dus belangrijk om te studeren van neurale stamcellen en progenitor cel populaties om deze eerdere processen beter te begrijpen. Organoid systemen, die beschouwd als beter recapituleren de ontwikkeling van de menselijke hersenen vanwege hun 3D natuur en overzichtelijke structuur weergegeven zijn, bevatten een voorvader zwembad dat is gebruikt om te bestuderen van enkele van deze eerdere gebeurtenissen. Echter de voorlopercellen bevolking in organoids is vaak schaars en meer als radiale gliacellen dan neurale stamcellen of voorlopercellen cellen5,–15. Dus, zou het zinvol zijn om een hoge doorvoersnelheid methode om te studeren van de vroege stadia van neurologische in een actief proliferatieve-celpopulatie.
In het lab, hebben we een protocol dat gebruikmaakt van hiPSC afkomstige neurale voorlopercellen (NPC), een gemengde bevolking van neurale stamcellen en voorlopercellen thats zeer proliferatieve, om neurologische processen zoals proliferatie, cel migratie, te bestuderen en eerste proces (neurite) met de extensie. Deze testen werden ontwikkeld op basis van gebruikte technieken in ons lab voor decennia met succes studeren neurologische in rat en muis corticale culturen16,17,18,19,,20, 21,22,23. Nog belangrijker is, werd ook aangetoond dat fenotypes en regelgevende signalen die zijn gedefinieerd in de rat en muis cultuur-systemen sterk voorspellende van mechanismen die actief in vivo zijn zijn, met vermelding van de waarde van deze technieken16, 17,18,19,24. Na aanvankelijke differentiatie van hiPSCs naar NPC’s laten deze methoden om vitale ontwikkelings processen in een kwestie van dagen te bestuderen. Deze methoden hebben veel voordelen: (1) zij vereisen wat geavanceerde apparatuur en zijn eenvoudig te implementeren, (2) de vele experimentele replicatieonderzoeken kunnen worden uitgevoerd in een korte periode van tijd, waardoor voor snelle bevestiging van de reproduceerbaarheid van de resultaten, en (3) cultuur variabelen zoals coating matrices, effecten van groeifactoren en activiteit van drugs kunnen snel en kosteneffectief worden getest. Bovendien, we profiteren van de reeds lang gevestigde rol van extracellulaire groeifactoren als kritische regelgevers van uiteenlopende ontwikkelings processen. NPC’s werden blootgesteld Schakel developmental signalen die direct stimuleren gebeurtenissen zoals proliferatie, neurite uitgroei en cel migratie, en vonden dat ze het vermogen om te identificeren van de gebreken die niet herkenbaar in controle voorwaarden19 , 25 , 26 , 27 , 28. ook het gemak van de beoordeling van geneesmiddelen biedt een krachtige Laan precisie geneeskunde technieken om te testen van de werkzaamheid van verschillende therapeutische interventies vast te stellen. Dus, dit protocol vergemakkelijkt een hoge doorvoer, reproduceerbaar, en eenvoudige methode om te studeren van de vroege ontwikkeling van de hersenen, pathogenese van de ziekte en de potentiële positieve effecten van groeifactoren en drugs op neurologische fenotypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protocollen die hier gepresenteerd illustreren snelle en eenvoudige methoden om te studeren fundamentele neurologische processen en groeifactoren en drugs met behulp van hiPSC-afgeleide neurale voorlopercellen testen. hiPSC technologie heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van de pathogenese van neurologische ziekten door het verstrekken van ons met ongekende toegang tot levende menselijke neuronale cellen van getroffen individuen. Inderdaad, zijn er talrijke hiPSC studies van neurologische aandoeningen, met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door van de gouverneur van de New Jersey Raad voor medisch onderzoek en behandeling van autisme (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markeert familie Stichting, Mindworks charitatieve Lead vertrouwen en de Stichting van de Joodse Gemeenschap van grotere Arizona NJ.
Materials
| PSC Neural Induction Medium: Protocol Link: https://goo.gl/euub7a |
ThermoFischer Scientific | A1647801 | This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium |
| Advanced DMEM/F12 Medium | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | Component of 100% Expansion Medium |
| Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103049 | Component of both NIM and 100% Expansion Medium |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) |
| Y-27632 (2HCl), 1 mg | Stem Cell Technologies | 72302 | ROCK inhibitor |
| 6 well plates | Corning | COR-3506 | Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay |
| 24 well plates | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay |
| 35 mm dishes | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | Substrate for coating plates |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific | 15140122 | Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1X Cell Detachment Solution |
| 2.5% Trypsin (10X) | Gibco | 15090-046 | 10X enzymatic solution |
| 0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay |
| tritiated [3H]-thymidine | PerkinElmer | NET027E001 | Radioactive tritium, thymidine |
| Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-1 | Vials for liquid scintillation counting |
| EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | Liquid scintillation cocktail |
| LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter | Beckman Coulter | 8043-30-1194 | Liquid Scintillation Counter |
| Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 | Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. | Semi-automatic cell harvester | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | Assessing viability of cells |
| Grade GF/C filter paper | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | Glass fiber filter paper |
| Human Basic FGF-2 | Peprotech | 100-18B | growth factor |
| Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | neuropeptide |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
- Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
- Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
- Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
- Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
- Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
- Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
- Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
- Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
- Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
- Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
- Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
- Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
- Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
- Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
- Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
- Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
- Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
- Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
- Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
- Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
- Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
- Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
- Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
- Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
- Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
- Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
- Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
- Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
- Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
- Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
- Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
- Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
- Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
- . GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017)
- . Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017)
