Langtidsstudier er nødvendigt for at forstå processen med udviklingen og mekanismer for tilpasning. Disse undersøgelser kræver som regel, forpligtelser ud over levetid af forskere. Her, er en kraftfuld metode beskrevet som dramatisk forskud state-of-the-art dataindsamling for at generere tidsseriedata i naturlige systemer.
Langtidsstudier aktiverer identifikation af øko-evolutionære processer, der finder sted over længere perioder. Derudover giver de centrale empiriske data, der kan bruges i prognosemodeller for at forudsige evolutionære svar af naturlige økosystemer til fremtidige miljøforandringer. Men bortset fra nogle få undtagelsestilfælde, langtidsstudier er knappe på grund af logistiske vanskeligheder forbundet med at få adgang til tidsmæssige prøver. Tidsmæssige dynamics er ofte studerede i laboratoriet eller i kontrolleret mesokosmoslangtidstest eksperimenter med særlige undersøgelser, at rekonstruere evolutionen af naturlige populationer i naturen.
Her, er en standard operating procedure (SOP) fastsat til at genoplive eller genoplive hvilende Daphnia magna, en udbredt zooplankton keystone arter i vandøkosystemer, at dramatisk fremme den state-of-the-art langsgående dataindsamling i naturlige systemer. Opstandelse månedvist var defineret i 1999 af Kerfoot og kollegaer, selvom første forsøg på rugeæg diapausing zooplankton æg dateres tilbage til slutningen af 1980erne. Siden Kerfoots skelsættende papir anvendes metodologi resurrecting zooplankton arter oftere og oftere, selvom formeret blandt laboratorier kun via direkte vidensoverførsel. Her, en SOP er beskrevet som giver en trinvis protokol på praksis af resurrecting hvilende Daphnia magna æg.
To vigtige undersøgelser er forudsat i som fitness svar genoplivet Daphnia magna befolkninger til opvarmning måles, capitalizing om muligheden for at studere historiske og moderne befolkninger i de samme indstillinger. Endelig diskuteres anvendelsen af næste generation sequencing teknologier til genoplivede eller stadig sovende faser. Disse teknologier giver hidtil uset magt i dissekere de processer og mekanismer, evolution hvis anvendes til befolkninger, der har oplevet ændringer i selektivt pres over tid.
Langtidsstudier er afgørende for at forstå økologiske og evolutionære processer i naturen og i vurderingen af hvordan arter reagere på og fortsætter under miljøændringer1. Dette skyldes, at øko-evolutionære processer sker på tværs af generationer og sker der ændringer i miljøet over lang tid spænder. Desuden giver langsigtede undersøgelser centrale empiriske data, der forbedrer nøjagtigheden af prædiktiv modellering til prognose evolutionære svar af naturlige økosystemer til miljøforandringer2. Rigtigheden af disse modeller er af afgørende betydning at gennemføre forvaltnings- og bevarelsesforanstaltninger strategier for at bevare biodiversiteten og økosystemfunktionerne.
Bortset fra nogle få undtagelsestilfælde (f.eks., Galapagos Darwin finker3 og alger4) er langtidsstudier stort set begrænset til arter med kort generationstid, der kan overføres i laboratoriet5,6 , 7 , 8. dermed processer bag evolutionære dynamics fortsat undvigende. På grund af logistiske vanskeligheder forbundet med at få adgang til tidsmæssige prøver, empiriske data er undersøgt oftere i en rumlig end i en tidsmæssig sammenhæng, og tidsmæssige øko-evolutionære processer udledes eller modelleret fra geodata. Denne fremgangsmåde er kendt som plads-for-time substitution9, hvorved rummet er vedtaget som en surrogat at studere tidsmæssige evolutionære dynamics. Den største begrænsning af plads-for-time substitution er, at satserne for tilpasning på forskellige rumlige skalaer adskiller sig fra tidsmæssige variation i den samme population. dermed er slutninger baseret på udskiftning af tid med plads forudindtaget10.
Et stærkt alternativ, der giver mulighed for at studere evolutionære dynamics i naturlige økosystemer over tid er analysen af økologiske og genetiske ændringer i arter producerer inaktive faser11. Disse hvilende faser ophobes til form stratificeret biologiske arkiver, der kan dateres præcist og paleolimnologically karakteriseret12,13. Vigtigere, kan disse hvilende faser genoplivet og bruges i laboratorieforsøg, hvor deres evolutionære reaktion på ændringer i miljøet kan måles direkte. Historiske befolkninger kan være konkurrerede mod deres moderne udviklet efterkommere at studere fitness ændringer og funktionen af gener, der udvikler sig i takt med ændringer i miljøet14,15,16.
Hvilende faser omfatter frø, cyster, sporer, og æg banker. Selv om de første undersøgelser på genoplivet hvilende æg kan dateres tilbage til den sent 1980s17, og en håndfuld af undersøgelser har anvendt denne teknik i den tidlige 1990s18,19, har opstandelse månedvist været formelt etableret af skelsættende papiret af Kerfoot og kollegaer i 199920. Denne praksis har været anvendt hovedsageligt i paleolimnological rekonstruktioner af ferskvandsarter17,21,22. Dog er en SOP endnu ikke tilgængelige. Her, er en trinvis beskrivelse af opstandelsen protokollen anvendes til hvilende æg af zooplankton arter Daphnia magna fastsat, fra prøveudtagning af sediment til etablering af klonede kulturer fra hatchlings. Trin af SOP, der let kan overføres til andre arter af dafnier, samt foranstaltninger, der kan kræve yderligere optimering, der diskuteres.
Dafnier er ferskvand zooplankters stede i fleste af lotiske levesteder23 . Dafnier arter er enten obligat aseksuel eller cykliske parthenogens. D. magna er en cyklisk parthenogen, der gengiver alsidighed under gunstige miljømæssige forhold24. Når miljømæssige forhold forværres, opstår, mandlige produktion og seksuel rekombination fører til dannelsen af befrugtede æg, der komme i en tilstand af vækstdvale beskyttet fra miljøet af chitin tilfælde kaldet ephippium. En del af disse hvilende æg klækkes når gunstige miljømæssige forhold vender tilbage. En stor del af de hvilende egg bank har dog aldrig en chance for at luge og dermed opbygge biologisk arkiver over tid. Hvilende faser forblive begravet i sediment af søer og damme og kan genopstå for studiet af evolutionære dynamics over længere perioder. Fordi hvilende æg D. Magna er resultatet af seksuel rekombination, er de en god repræsentation af den naturlige genetiske mangfoldighed af arter25. De kan desuden opretholdes via klonede reproduktion i laboratoriet. Disse egenskaber giver den unikke fordel af isogene modelorganismer, samtidig bevare den naturlige genetiske mangfoldighed.
To vigtige undersøgelser præsenteres for at demonstrere fordelene ved direkte sammenligning af historiske og moderne efterkommere af den samme befolkning D. Magna oplever miljømæssige udvælgelse pres over tid. D. magna prøver blev genoplivet fra Lake Ring (Danmark), en lavvandet (5 m dybde; overflade 22 ha) blandet Dam, der har oplevet en stigning i gennemsnitlige temperatur og hedebølger forekomsten over tid. D. magna (sub) populationer blev genoplivet langs denne tidsmæssige forløb der strækker sig over 60 år (1960-2005) og studerede for at undersøge evolutionære reaktion på temperatur opvarmning. I den første undersøgelse i en fælles haven eksperiment, blev ændringer i fitness-linked livshistorie træk målt som reaktion på en stigning i temperatur på + 6 ° C, i overensstemmelse med forudsigelser af det Mellemstatslige Panel for klimaændringer for de kommende 100 år 26. i den anden undersøgelse, en mesokosmoslangtidstest eksperiment blev brugt til at måle tre konkurrencedygtige evner (under) populationer under opvarmning. Disse eksperimenter kombineret viser, at i tilstedeværelse af opvarmning som den eneste stress, alle livshistorie træk og befolkninger viser en høj grad af plasticitet og har lige konkurrencedygtige evner. Disse resultater tyder på, at opvarmning som en enkelt stress ikke pålægger signifikant fitness omkostninger, i det mindste i befolkningen studerede her.
På grund af den høje varmeledningsevne af vand ferskvand økosystemer på højere risiko for tab af biodiversitet end terrestriske økosystemer i lyset af global opvarmning34. Det er derfor afgørende at forstå svar af keystone arter i disse økosystemer og identificere overlevelsesmekanismer for at overleve termisk stress. Forståelsen af disse mekanismer på arter og Fællesskabets niveau kan hjælpe med at forudsige hvordan arter er påvirket af den globale opvarmning og hvordan effekten på enkelte arter kaskader til andre trofiske niveauer. I sidste ende, forstå mekanismer af svar til den globale opvarmning muliggør identifikation af oprydningsstrategier at afbøde udryddelser.
Casestudier præsenteres her viser at svar på D. magna temperaturstigning korrekt er medieret af plasticitet i livshistorie træk og reaktion på temperaturstigning alene ikke pålægger klart fitness omkostninger, i det mindste i den befolkningen studerede her. Høj plasticitet i livshistorie træk understøttes af ikke-væsentlige forskelle i konkurrerende evner af (under) populationer i overværelse af opvarmning. Langsigtede konkurrence forsøg på flere befolkninger kan dog nødvendigt at generalisere disse resultater.
Opstandelsen af hvilende etaper giver en hidtil uset ressource for at studere mekanismer for tilpasning og baner af en artens udvikling gennem tiden10. Zooplankton arter drage fordel af en hurtig generationstid (ca. 2 uger) og levedygtigheden af hvilende faser, som giver mulighed for en forfader til at konkurrere headtohead mod sine egne efterkommere eller ‘replay’ evolution, der starter fra forskellige tidligere stater. Opstandelse økologi giver væsentlige undersøgelse af, om en bestemt evolutionære resultatet er betinget af en forudgående begivenhed. Identifikation af de genetiske elementer af evolution er i øjeblikket muligt i laboratorieforsøg, der ved hjælp af mikroorganismer som ‘forfædres lines’ frosset og genoplivet for sammenlignende analyse med deres udviklede efterkommer6. En af de vigtigste begrænsninger for at arbejde med laboratoriet organismer er imidlertid, at fædrene staten er en allerede flyttet baseline. Studiet af hvilende etaper giver mulighed for udtagning af prøver fra tiden før nogen stress begivenhed (f.eks., uberørte miljøforhold) og til at måle evolutionære baner fra uforstyrret miljømæssige forhold til forskellige tidligere stater indtil moderne tid. I de seneste år, har studiet af DNA polymorfi i opstandne eller stadig sovende zooplankton faser givet vigtige indsigt i seneste demografiske og adaptive processer, der har bidraget til den genetiske makeup af nutidens befolkninger14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. med den højere tilgængelighed af høj overførselshastighed sekventering teknologier, genom og transkriptom opstandne eller stadig sovende etaper kan blive sekventeret og typen og antallet af genetiske ændringer akkumuleret i udviklende befolkninger tid målt.
Opstandelse SOP præsenteres her har vigtige applikationer inden for multi-omik på to niveauer. Multi-omik-teknologier kan anvendes til opstandne prøver, giver en udtømmende analyse af de molekylære elementer involveret i adaptive responser til miljømæssige udvælgelse pres. Derudover kan omik-teknologier anvendes til decapsulated men stadig sovende faser. Hidtil, har anvendelse af høje overførselshastighed sekventering teknologier til hvile faser været begrænset af kravet om en stor mængde af input materiale. Disse begrænsninger bliver løftet37. Sænke kravene til materialer og fremskridt i nanofluidics, hele genome sequencing (WGS) er nu muligt fra så lidt som 1 ng eller et par pg starte materielle38. Brug af hele genom forstærkning (WGA) og hele transkriptom forstærkning (WTA) teknikker, gør det muligt for berigelse af DNA og RNA fra meget små mængder af væv, har revolutioneret både metagenomics39,40 og medicinsk forskning41. Disse teknologier anvendt på decapsulated hvilende æg aktiverer overskridelse af begrænsninger i forbindelse med levedygtighed af hvilende faser og undersøge for længere perioder (fx, århundreder).
Opstandelsen af hvirvelløse samfund producerer hvilende faser muliggør tilpasning af Fællesskabets historier med kendte ændringer i de naturlige landskaber eller miljømæssige ændringer udledes fra analyser af sedimenter orsoils2. Analysen af Fællesskabets ændringer som reaktion på ændringer i miljøet giver os evnen til at kvantificere øko-evolutionære feedbacks42 at have betydelige konsekvenser for befolkningen persistens43, trofiske interaktioner44 , Fællesskabet forsamling45, og ændringer i økosystemets funktioner og tjenester,46. Endelig, nøjagtige forudsigelser om biologiske svar til miljøændringer er altafgørende at guide beskyttelse af biodiversitet47. Nuværende prognosemodeller er urigtige i denne henseende, fordi de ikke tager hensyn vigtige biologiske mekanismer som demografi, spredning, evolution og arter interaktioner. Forstå, hvordan disse processer ændrer sig med tiden og bruge disse oplysninger som en forudgående i prognose modellering vil forbedre vores evne til at forudsige arter og Fællesskabets vedholdenhed over for miljømæssige ændre2.
Anvendelse af SOP præsenteres her er ikke uden udfordringer. Den primære begrænsning af resurrecting hvilende faser er behovet for specialiseret udstyr til prøveudtagning. Derudover kræver hele processen, fra sediment sigtning til etablering af klonede kulturer, betydelig hands-on tid.
Nogle af de SOP skridt præsenteret her er let overføres til andre arter, dafnier . Disse er: prøvetagning, etablering af klonede linjer og eksperimenterende design. Men andre trin af SOP kan kræve yderligere optimering skræddersyet til arter under undersøgelsen. Udpakning er ofte anvendes til D. magna prøver at forbedre rugeæg succes. Denne fremgangsmåde kan dog ikke være egnet til mindre enheder. Rugeæg stimuli kan også variere blandt arter48 og conspecific prøven49. Derfor, en ad hoc- optimering af rugeæg trin af SOP kan være påkrævet før applikationer til andre krebsdyr. Mens rugeæg succes med befolkningens D. magna genopstå fra Lake Ring (30,5% på tværs af sedimentære arkivet) er i overensstemmelse med tidligere resultater49, varierer rugeæg succes med tilstanden bevarelse af sediment, art 50,51, og den geografiske oprindelse af sediment48. Fremtidige studier af de mekanismer, der regulerer løsning og progression gennem faserne i diapause er forpligtet til at identificere optimale rugeæg stimuli skræddersyet til forskellige arter.
Endelig baggrund kendskab til den undersøgelse system, især tilstedeværelsen af arter af interesse over tid, er tilrådeligt. Dette kan opnås via historiske optegnelser. Hvis historiske optegnelser, ikke er tilgængelige, er prøveudtagning og screening af de overflade lag af søen sediment inden core prøveudtagning tilrådeligt, selv om det kan give oplysninger kun om den seneste historie.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NERC højdepunkter grant (NE/N016777/1). Ensis Ltd, videnskabelige miljøtjenester, Environmental Change Research Centre, University College London stikprøven og dateret sediment kerne.
sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
geological sieve | UKGE limited | SV7521 | 200 mm diameter geological sieve – 1 mm mesh |
geological sieve | UKGE limited | SV7525 | 200 mm diameter geological sieve – 0.125 mm mesh |
white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
pasteur pipette | Globe Scientific inc. | 138020B | Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw – 0.9mL |
stereo microscope | nikon | smz800 | Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit |
petri dish | EduLab | 153-533 | Sterile 90mm diameter plastic petri dish |
glass jars | compak | Round Jam Jars 4oz | 100 mL jars |
glass jars | compak | Atum Jars/ Bonta Jar 10oz | 200 mL jars |
glass jars | bottlecompanysouth | 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid | 500 mL jars |
statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
image software | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | na | Open source ImageJ image processing toolkit written in Java |
mesocosm | amazon | na | Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter |
mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick – Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 – Size standard compatible with ABI sequencers |
ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |