Långsiktiga studier är nödvändig för att förstå processen för evolution och mekanismerna för anpassning. Generellt kräver dessa studier åtaganden utöver livslängd av forskare. Här beskrivs en kraftfull metod att dramatiskt framsteg state-of-the-art datainsamling för att generera longitudinella data i naturliga system.
Långsiktiga studier möjliggöra identifiering av eco-evolutionära processer som uppstår över längre tidsperioder. Dessutom ger de viktiga empiriska data som kan användas i prognosmodeller för att prognostisera evolutionära Svaren av naturliga ekosystem till framtida miljöförändringar. Men exklusive några undantagsfall är långtidsstudier knappa på grund av logistiska svårigheterna med att komma åt temporal prover. Temporal dynamics studeras ofta i laboratoriet eller i kontrollerade mesokosmos experiment med enastående studier att rekonstruera utvecklingen av naturliga populationer i vilt.
Här, föreskrivs ett normalförfarande (SOP) att återuppliva eller återuppliva vilande Daphnia magna, en utbredd djurplankton keystone arter i akvatiska ekosystem, för att dramatiskt avancera state-of-the-art longitudinella datainsamling i naturliga system. Fältet för uppståndelsen ekologi definierades 1999 av Kerfoot och medarbetare, även om första försöken på kläckning diapausing djurplankton ägg går tillbaka till slutet av 1980. Sedan Kerfoots nyskapande papper, har metodiken för uppväcker djurplankton arter allt oftare tillämpats, men sprids bland laboratorier endast via direkta kunskapsöverföring. Här, en SOP beskrivs som ger en steg för steg-protokollet på öva av uppväcker vilande Daphnia magna ägg.
Två viktiga studier tillhandahålls i som fitness svar uppståndna Daphnia magna befolkningar att uppvärmningen mäts, kapitalisera på förmågan att studera historiska och moderna populationer i samma inställningar. Slutligen diskuteras tillämpningen av nästa generations sekvensering tekniker på återupplivade eller fortfarande vilande stadier. Dessa tekniker ger oöverträffad makt i dissekera de processer och mekanismer som evolutionsteorin om tillämpas på populationer som har upplevt förändringar i urval tryck över tid.
Långsiktiga studier är avgörande för att förstå ekologiska och evolutionära processer i naturen och i bedömningen av hur arter svarar på och kvarstår under miljöförändringar1. Detta beror på att eco-evolutionära processer inträffar över generationer och förändringar i miljön sker över lång tid intervallen. Långsiktiga studier ger dessutom viktiga empiriska data att förbättrar noggrannheten i förutsägande modellering att prognostisera evolutionära Svaren av naturliga ekosystem till miljöförändringar2. Riktigheten av dessa modeller är avgörande för förvaltning och bevarande strategier för att bevara biologisk mångfald och ekosystemtjänster.
Exklusive några undantagsfall (t.ex., Galapagos Darwin finkar3 och alger4) är långsiktiga studier i stort sett begränsade till arter med kort generationstid som kan spridas i laboratoriet5,6 , 7 , 8. därför de processer som underbygger evolutionära dynamics förbli svårfångade. På grund av logistiska svårigheterna med att komma åt temporal prover, empiriska data studeras oftare i en rumslig än i ett temporal sammanhang, och temporala eco-evolutionära processer är slutsatsen eller modellerad från spatialdata. Denna metod kallas ‘utrymme-för-tid’ substitution9, whereby utrymme antas som ett surrogat att studera temporal evolutionära dynamics. Den största begränsningen av ‘utrymme-för-tid’ substitution är att andelen anpassning på olika rumsliga skalor skiljer sig från temporal variation i samma population; Därför är slutsatser baserat på byte av tid med utrymme partisk10.
Ett kraftfullt alternativ som gör att studera evolutionära dynamics i naturliga ekosystem över tid är analysen av ekologiska och genetiska förändringar i arter producerar vilande stadier11. Dessa vilande stadier ackumuleras till formuläret stratifierat biologiska arkiv som kan dateras exakt och paleolimnologically kännetecknas12,13. Ännu viktigare, kan dessa vilande stadier återupplivat och användas i laboratorieexperiment, där deras evolutionära svar på miljöförändringar kan mätas direkt. Historiska populationer kan vara tävlade mot deras moderna utvecklade ättlingar att studera fitness förändringar och funktion av gener som utvecklas i takt med miljöförändringar14,15,16.
Vilande stadier inkluderar frön, cystor, sporer och ägg banker. Även om de första studierna på återupplivat vilande ägg går tillbaka till det sena 1980-talet17, och en handfull studier har tillämpat denna teknik i början av 1990-talet18,19, har fältet av uppståndelsen ekologi varit formellt etablerad av den inflytelserika tidningen Kerfoot och medarbetare 199920. Denna praxis har tillämpats främst i paleolimnological rekonstruktioner av sötvattensarter17,21,22. Dock finns en SOP inte ännu. Här erbjuds en stegvis beskrivning av uppståndelsen protokollet tillämpas på vilande ägg av djurplankton arten Daphnia magna , från provtagning av sediment till etableringen av klonala kulturer från ungarna. Steg av SOP som kan lätt överföras till andra arter av Daphnia, liksom åtgärder som kan kräva ytterligare optimering, diskuteras.
Daphnia är sötvatten zooplankters närvarande i flesta lotiska livsmiljöer23 . Daphnia -arter är antingen obligata asexuell eller cykliska parthenogens. D. magna är en cyklisk parthenogen som återger klonalt under gynnsamma miljöförhållanden24. När miljöförhållanden försämras, manliga produktion uppstår och sexuella rekombination leder till bildandet av befruktade ägg som anger ett tillstånd av dvala skyddas från miljön av chitinen fall kallas ephippium. En del av dessa vilande ägg kläcks när gynnsamma miljöförhållanden tillbaka. En stor del av vilande ägg banken har dock aldrig en chans att kläckas och därmed bygga upp biologiska arkiv över tid. Vilande stadier förbli begravda i sediment i sjöar och dammar och kan återuppstå för att studera evolutionära dynamics längre period. Eftersom vilande ägg av D. magna är resultatet av sexuella rekombination, är de en bra representation av den naturliga genetiska mångfalden av arter25. Dessutom kan de upprätthållas via klonal reproduktion i laboratoriet. Dessa egenskaper ger den unika fördelen med syngena modellorganismer, men behåller den naturliga genetiska mångfalden.
Två viktiga studier presenteras för att visa fördelarna med direkt jämföra historiska och moderna ättlingar av samma population av D. magna upplever miljön selektionstryck över tid. D. magna exemplar var uppstånden från sjön Ring (Danmark), ett grunt (5 m djup; yta 22 hektar) blandade damm som har upplevt en ökning i genomsnittlig temperatur och värmeböljor förekomst över tid. D. magna (under) populationer var uppståndna längs denna tidsmässiga lutning som spänner över 60 år (1960 – 2005) och studerade för att undersöka evolutionärt svar på temperatur uppvärmningen. I den första studien i en gemensam trädgård experiment mättes förändringar i fitness-länkade livshistoria drag som svar på en ökning av temperaturen på + 6 ° C, i linje med förutsägelser av den mellanstatliga panelen för klimatförändringar under de kommande 100 åren 26. i den andra studien användes ett mesokosmos experiment att mäta tre konkurrenskraftiga förmågor (under) populationer under uppvärmningen. Dessa experiment kombinerat visar att i närvaro av uppvärmningen som bara stress, alla livshistoria drag och populationer visar hög plasticitet och har lika konkurrenskraftiga förmågor. Dessa fynd tyder på att uppvärmningen som en inre stress medför betydande fitness kostnader, åtminstone i befolkningen studerats här.
På grund av den höga värmeledningsförmågan av vatten, sötvatten ekosystem på högre risk för förlust av biologisk mångfald än terrestra ekosystem inför globala uppvärmningen34. Det är därför avgörande för att förstå svaret av keystone arter i dessa ekosystem och identifiera coping mekanismer för att överleva termisk stress. Förståelsen av dessa mekanismer på arter och gemenskapens nivå kan hjälpa till att förutsäga hur arter påverkas av den globala uppvärmningen och hur inverkan på enskilda arter kaskader till andra trofiska nivåer. Slutändan, förstå mekanismerna bakom Svaren till den globala uppvärmningen möjliggör identifiering av saneringsstrategier att mildra utdöenden.
De fallstudier som presenteras här visar att D. magna svar på temperaturökning pervasively medieras av plasticitet i livshistoria drag och att svar på temperaturökning ensam inte ålägger tydlig fitness kostnader, åtminstone i den befolkningen studerats här. Hög plasticitet i livshistoria egenskaper stöds av icke-signifikanta skillnader i konkurrerande kapaciteterna av de (under) populationerna i närvaro av uppvärmningen. Längre sikt konkurrens experiment på flera populationer kan dock nödvändigt att generalisera dessa fynd.
Uppståndelsen av vilande stadier ger en oöverträffad resurs för att studera mekanismer för anpassning och banor för en Arts evolution genom tiden10. Djurplankton arter gynnas en snabb generationstid (ca 2 veckor) och livskraft vilande stadier, vilket gör att en förfader till konkurrera headtohead mot dess egna ättlingar eller till ‘replay’ evolution som startar från olika tidigare stater. Uppståndelsen ekologi kan i huvudsak utredning av huruvida ett visst evolutionära resultat är beroende av någon tidigare händelse. Identifiering av de genetiska element av evolution är för närvarande möjligt i laboratorieexperiment med mikroorganismer som ‘fäderneärvda linjer’ är fryst och återupplivat för jämförande analys med deras utvecklade ättling6. Dock är en av de viktigaste begränsningarna av att arbeta med laboratorium organismer att ‘fäderneärvda staten’ är en redan skiftat baslinjen. Studien av vilande stadier tillåter provtagning av exemplar från tiden som föregick helst stress (t.ex., orörda miljöförhållanden) och att mäta evolutionära banor från opåverkade miljömässiga förhållanden till olika tidigare stater fram till moderna tider. Under senare år har gett studier av DNA polymorfism i uppståndne eller fortfarande vilande djurplankton stadier viktiga insikter i senaste demografiska och adaptiva processer som bidragit till den genetiska makeupen av nuvarande populationerna14 , 16 , 25 , 33 , 35 , 36. med hög genomströmning sekvensering teknik högre tillgänglighet, det genomet och transkriptom uppståndne eller fortfarande vilande stadier kan sekvenseras och typ och antal genetiska förändringar ackumuleras i utvecklas populationer över tid mäts.
Uppståndelsen SOP som presenteras här har viktiga tillämpningar inom multi-omics på två nivåer. Multi-omics teknik kan tillämpas på uppståndne exemplar, ger en uttömmande analys av de molekylära faktorer inblandade i adaptiv Svaren till miljömässiga selektionstryck. Dessutom kan omics teknik tillämpas på decapsulated men fortfarande vilande stadier. Tillämpningen av hög genomströmning sekvensering teknik till vilande stadier har hittills begränsats av kravet på en stor mängd insatsmaterial. Dessa begränsningar är att vara upplyft37. Sänka kraven för insatsmaterial och framsteg i nanofluidik, hela Genomsekvensering (WGS) är nu möjligt från så lite som 1 ng eller några pg av start material38. Användning av hela genomet amplifiering (WGA) och hela transkriptom amplifiering (WTA) tekniker, aktivera anrikningen av DNA och RNA från mycket små mängder av vävnad, har revolutionerat både metagenomik39,40 och sjukvård forskning41. Dessa tekniker som tillämpas på decapsulated vilande ägg aktivera överskrida av begränsningar som är associerade med livskraft vilande stadier och utrednings för längre period (t.ex., århundraden).
Uppståndelsen av ryggradslösa samhällen producerar vilande stadier kan anpassningen av gemenskapens historier med kända förändringar i landskap, eller med miljöförändringar som innebäras från analyser av sediment orsoils2. Analys av gemenskapens förändringar i svar på miljöförändringar ger oss möjlighet att kvantifiera eco-evolutionära återkopplingar42 som har betydande konsekvenser på befolkningens uthållighet43, trofiska interaktioner44 , gemenskapen montering45, och förändringar i ekosystem funktioner och tjänster46. Slutligen, korrekta förutsägelser om biologiska Svaren till miljöförändringar är avgörande att vägleda skyddet av biologisk mångfald47. Nuvarande prediktiva modeller är felaktig i detta avseende eftersom de inte tar in i konto viktiga biologiska mekanismer såsom demografi, spridning, evolution och arter interaktioner. Förstå hur dessa processer förändras över tid och använda denna information som en tidigare prognos modellering kommer att förbättra vår förmåga att förutse arter och gemenskapens uthållighet inför miljömässiga ändra2.
Tillämpningen av SOP presenteras här saknar inte utmaningar. Primära begränsning av uppväcker vilande stadier är behovet av specialutrustning för provtagning. Dessutom kräver hela processen, från sediment siktning till etableringen av klonala kulturer, betydande praktiska tid.
Några av de SOP-stegen som presenteras här kan lätt överföras till andra Daphnia -arter. Dessa är: provtagning, etablering av klonala linjer och experimentell design. Andra steg i SOP kan dock kräva ytterligare optimering anpassad till arten under studien. Avkodning av inkapsling är ofta tillämpas på D. magna prover att förbättra kläckning framgång. Detta tillvägagångssätt kan dock inte lämplig för mindre prover. Kläckning stimuli kan också variera mellan arter48 och hawaiimonark preparatet49. Därför krävas en ad hoc- optimering av kläckningen stegen i SOP före applikationer till andra kräftdjur. Kläckning framgången av D. magna befolkningen uppstånden från Ringsjön (30,5% över sedimentära arkivet) är i linje med tidigare resultat49, varierar kläckning framgång med bevarandet av sediment, arterna 50,51, och sediment48geografiska ursprung. Framtida studier på de mekanismer som reglerar inresa och progression genom faser av diapause krävs att identifiera optimala kläckning stimuli anpassade till olika arter.
Slutligen, bakgrund kunskap om studien, särskilt förekomsten av arter av intresse över tid, är tillrådligt. Detta kan åstadkommas via historiska dokument. Om historiska poster inte är tillgängliga, är provtagning och screening av ytbehandlalagrarna av sedimenten i sjön före core provtagningen lämpligt, även om det kan ge information endast om den senaste historia.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NERC höjdpunkter bidraget (NE/N016777/1). Ensis Ltd, vetenskapliga miljötjänster, Environmental Change Research Centre, University College London provtas och daterad sediment kärnan.
sampling bags | Fisher Scientific | 11542783 | Sampling bag revolve round wires closure system and safety tabs sterile polyethylene with writing area clear 89µm thickness 140mm x 229mm, 720mL Fisherbrand |
piston corer | ENSIS ltd | na | Long, heavy tube plunged into the sea, lake, pond floor to extract samples of mud sediment. Piston corers have a viariable diameter and are generally in PVC |
precision scale | Veritas-M124A | TLP-50 | Analytical Balance |
geological sieve | UKGE limited | SV7521 | 200 mm diameter geological sieve – 1 mm mesh |
geological sieve | UKGE limited | SV7525 | 200 mm diameter geological sieve – 0.125 mm mesh |
white sampling tray | nhbs | http://www.nhbs.com/title/view/159614?ad_id=1509 | Standard mulipurpose lab trays |
pasteur pipette | Globe Scientific inc. | 138020B | Transfer Pipet, 1.7mL, General Purpose, 87mm, Bulb Draw – 0.9mL |
stereo microscope | nikon | smz800 | Microscope with magnification range 1x -8x linked to a camera control unit |
petri dish | EduLab | 153-533 | Sterile 90mm diameter plastic petri dish |
glass jars | compak | Round Jam Jars 4oz | 100 mL jars |
glass jars | compak | Atum Jars/ Bonta Jar 10oz | 200 mL jars |
glass jars | bottlecompanysouth | 500ml Food Jam Jar With Twist Off Lid | 500 mL jars |
statistical software R | https://cran.r-project.org/ | na | Free online GNU language and environment for statistical computing and graphics |
microdissection forceps | Fisher Scientific | 41122405 | Fine point stainless steel forceps for microdissections |
image software | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | na | Open source ImageJ image processing toolkit written in Java |
mesocosm | amazon | na | Nobby Fauna-Box III, 41 x 23 x 29 cm, 20.0 Liter |
mirocentrifuge tubes | Sigma_Aldrick – Merck | Z606340 | premium microcentrifuge tubes 1.5 mL |
AGENCOURT DNAdvance | Beckman Coulter | A48705 | DNA extraction kit |
size standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | LIZ500 – Size standard compatible with ABI sequencers |
ABI3032 sequencer | ABI | na | Sequencer used to perform fragment analysis or sanger sequencing |