एक उपन्यास इन विट्रो लाइव-इमेजिंग Astrocyte की परख-मध्यस्थता Phagocytosis का उपयोग पीएच संकेतक-संयुग्मित Synaptosomes
Summary
इस प्रोटोकॉल एक इन विट्रो लाइव इमेजिंग phagocytosis परख के लिए astrocytes की phagocytic क्षमता को मापने प्रस्तुत करता है । शुद्ध चूहा astrocytes और microglia पीएच संकेतक के साथ प्रयोग किया जाता है-संयुग्मित synaptosomes । इस विधि वास्तविक समय समाई और क्षरण कैनेटीक्स का पता लगाने और astrocyte phagocytosis संग्राहक कारकों की पहचान करने के लिए एक उपयुक्त स्क्रीनिंग मंच प्रदान करता है कर सकते हैं ।
Abstract
Astrocytes मस्तिष्क में प्रमुख कोशिका प्रकार के होते हैं और सीधे synapses और रक्त वाहिकाओं से संपर्क करते हैं । यद्यपि microglial कोशिकाओं प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर विचार किया गया है और केवल मस्तिष्क में फ़ैगोसाइट, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि astrocytes भी विभिन्न phagocytic प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं, जैसे विकासात्मक synapse उन्मूलन और की मंजूरी अल्जाइमर रोग (AD) में amyloid बीटा पट्टिकाएं । इन निष्कर्षों के बावजूद, astrocyte समाई और उनके लक्ष्य की गिरावट की क्षमता microglia के साथ तुलना में स्पष्ट नहीं है । जानकारी का यह अभाव अधिकांशतः एक परख प्रणाली की कमी के कारण होता है जिसमें astrocyte-और microglia-मध्यस्थता phagocytosis की कैनेटीक्स आसानी से तुलनीय होती हैं. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए हमने एक दीर्घकालिक लाइव-इमेजिंग इन विट्रो phagocytosis परख में विकसित किया है जो शुद्ध astrocytes और microglia की phagocytic क्षमता का मूल्यांकन करते हैं । इस परख में, समाई और क्षरण का वास्तविक समय का पता लगाने के पीएच संकेतक का उपयोग संभव है-संयुग्मित synaptosomes, जो अम्लीय organelles में चमकदार लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन, ऐसे lysosomes के रूप में । हमारे उपंयास परख लाइव इमेजिंग के माध्यम से phagocytosis का सरल और प्रभावी पता लगाने प्रदान करता है । इसके अलावा, इस इन विट्रो phagocytosis परख एक स्क्रीनिंग के लिए रसायनों और यौगिकों कि बढ़ाने या astrocytes की phagocytic क्षमता को बाधित कर सकते है की पहचान मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में synaptic छंटाई खराबी और रोगजनक प्रोटीन संचय के लिए मानसिक विकारों या neurodegenerative रोगों, रसायनों और यौगिकों कि glial कोशिकाओं की phagocytic क्षमता मिलाना विभिंन उपचार में सहायक होना चाहिए कारण दिखाया गया है मस्तिष्क संबंधी विकार ।
Introduction
Glial कोशिकाओं है, जो मस्तिष्क में गैर उत्तेजित कोशिकाओं को देखें, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में प्रमुख कोशिका प्रकार हैं । पहले, glial कोशिकाओं को केवल समर्थन कोशिकाओं के रूप में माना जाता है कि मुख्य रूप से ंयूरॉंस अस्तित्व और बेसल synaptic गुणों को बनाए रखने में निष्क्रिय भूमिकाओं खेलते हैं । हालांकि, उभरते सबूत से पता चला है कि glial कोशिकाओं तंत्रिका के विभिन्न पहलुओं में अधिक सक्रिय भूमिका निभाते हैं, मस्तिष्क homeostasis बनाए रखने के रूप में, मध्यस्थता synapse गठन1,2,3 और synapse उंमूलन4,5, और मॉडुलन synaptic प्लास्टिक6,7। सीएनएस में Glial कोशिकाओं में astrocytes, microglia और oligodendrocytes शामिल हैं । इन कोशिकाओं के अलावा, astrocytes और microglia synapses4,5, अपोप्तोटिक कोशिकाओं8, तंत्रिका मलबे9, और रोगजनक प्रोटीन, amyloid बीटा के रूप में छा द्वारा phagocytic भूमिकाओं खेलने के लिए दिखाया गया है सजीले टुकड़े10,11। विकासशील मस्तिष्क में, astrocytes MERTK के माध्यम से पृष्ठीय पार्श्व geniculate नाभिक (dLGN) में synapses को खत्म करने-और MEGF10-निर्भर phagocytosis4। इसी प्रकार, microglia भी C1q-लेपित synapses को खत्म करने के माध्यम से विकासात्मक चरणों के माध्यम से शास्त्रीय झरना5पूरक । दिलचस्प है, यह सुझाव दिया गया है कि synapse छंटाई में दोष कई स्नायविक विकारों के सर्जक में से एक हो सकता है । उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि घटक 4 (C4), जो पूरक-microglia द्वारा छंटाई synapse बढ़ जाती है पूरक में उत्परिवर्तनों, दृढ़ता से12मनुष्यों में एक प्रकार का पागलपन की व्यापकता के साथ जुड़े रहे हैं । हाल के एक पत्र में यह भी पता चला है कि शास्त्रीय पूरक मार्ग विज्ञापन के दीक्षा चरणों में hyperactivated है और इस रोग में जल्दी synapse नुकसान लाती है13.
microglia-मध्यस्थता phagocytosis के साथ तुलना में, चाहे astrocyte मध्यस्थता phagocytosis दीक्षा और विभिन्न स्नायविक विकारों की प्रगति के लिए योगदान कम स्पष्ट है. हालांकि, हाल के एक पत्र में पता चलता है कि कारकों है कि सामांय synapse astrocytes द्वारा छंटाई की दर में परिवर्तन मस्तिष्क homeostasis बाधित हो सकता है और विज्ञापन संवेदनशीलता और विकृति विज्ञान के लिए योगदान14। astrocytes द्वारा synapse छंटाई की दर शक्तिशाली ApoE isomers द्वारा नियंत्रित किया जाता है, विज्ञापन (एलील) के लिए एक सुरक्षात्मक ApoE2 के साथ दृढ़ता से दर बढ़ाने और विज्ञापन के लिए एक जोखिम एलील (ApoE4) काफी कम दर । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों पर नियंत्रण या ApoE2 चूहों14से ज्यादा synaptic C1q जमा ApoE4 व्यक्त । इन आंकड़ों का सुझाव है कि बिगड़ा astrocyte मध्यस्थता phagocytosis प्रारंभिक विज्ञापन मस्तिष्क में होनेवाला C1q-लेपित synapses के संचय के लिए प्रेरित हो सकता है/synaptic मलबे कि पूरक मध्यस्थता microglial phagocytosis, ड्राइविंग synaptic अध: पतन . ApoE4 वाहकों में astrocytes की बिगड़ी phagocytic क्षमता भी विज्ञापन-प्रभावित दिमाग में amyloid बीटा पट्टिकाओं के अनियंत्रित संचय में योगदान दे सकती है.
इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि Drosophila मस्तिष्क में glial कोशिकाएं ड्रेपर के कम अनुवाद के कारण अपनी phagocytic क्षमता खो देती हैं, एक homolog का Megf10 जो astrocytes phagocytosing के लिए उपयोग synapses है. ड्रेपर स्तर बहाल glial कोशिकाओं है, जो कुशलतापूर्वक युवा मस्तिष्क में है कि के रूप में एक ही हद तक वृद्ध मस्तिष्क में क्षतिग्रस्त axonal मलबे को मंजूरी दी की phagocytic क्षमता बचाया, यह दर्शाता है कि उंर बढ़ने प्रेरित phagocytic की क्षमता में परिवर्तन astrocytes मस्तिष्क के विघटन में योगदान दे सकता है homeostasis15.
इन नए निष्कर्षों के आधार पर, astrocytes की phagocytic क्षमता नियमन एक आकर्षक उपचारात्मक रणनीति को रोकने और विभिंन स्नायविक विकारों के इलाज हो सकता है । इस संबंध में, astrocytes की phagocytic क्षमता को बढ़ाने के लिए कई प्रयास किए गए हैं, उदाहरण के लिए, अम्लीय नैनोकणों के साथ lysosomes के अंलीकरण उत्प्रेरण द्वारा16 और प्रतिलेखनी कारक EB (TFEB), जो एंहांस कर सकते हैं lysosome उत्पत्ति17. इन प्रयासों के बावजूद, यह अभी भी अस्पष्ट है कि कैसे astrocytes और microglial कोशिकाओं को अपने phagocytic कैनेटीक्स में अलग है और क्या हम वृद्धि या विभिंन रोगों में अपनी phagocytic क्षमता में कमी करनी चाहिए ।
इस पत्र में, हम वास्तविक समय में astrocytes की phagocytic क्षमता का पता लगाने के लिए इन विट्रो परख में एक उपंयास प्रस्तुत करते हैं । डेटा astrocytes और microglia में समाई और गिरावट के विभिंन कैनेटीक्स दिखाते हैं । Astrocyte-वातानुकूलित मध्यम (ACM), जो astrocytes से स्रावित कारक होते हैं, दोनों astrocytes और microglia के प्रभावी phagocytosis के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, Megf10, astrocytes में एक phagocytic रिसेप्टर और सीईडी-1 और ड्रेपरके एक homolog, astrocyte-मध्यस्थता phagocytosis8,18में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अनुच्छेद में, हम एक लंबे समय तक रहने के लिए तरीकों वर्तमान इन विट्रो में phagocytosis परख शुद्ध glial कोशिकाओं और पीएच संकेतक का उपयोग कर-संयुग्मित synaptosomes । हम बताते है कि microglia के साथ तुलना में, astrocytes synaptosomes के phagocytosis क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक येयून-जोओ जंग उसके प्रायोगिक समर्थन के लिए synaptosome शोधन और Jungjoo पार्क के दौरान पुनश्च जोखिम के साथ synaptosomes की छवियों के लिए धंयवाद । इसके अलावा, हम सहायक चर्चा के लिए चुंग प्रयोगशाला में सभी सदस्यों को धंयवाद । यह काम कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) द्वारा वित्त पोषित अनुदान कोरियाई सरकार (MSIP) (एनआरएफ-2016M3C7A1905391 और एनआरएफ-2016R1C1B3006969) (डब्ल्यू.-एस. के द्वारा समर्थित किया गया था । ग).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
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