후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션
Summary
정액 액 화는 정액 젤에서 해방 될 정자에 대 한 필요 합니다. 이 연구는 여성 재생산 지역 포스트 성교에서 정액을 수집 하 고 정액 액 화 시간을 측정 하기 위한 절차를 제공 합니다.
Abstract
마우스에 ejaculated 정액은 자 궁에 입금 됩니다. 사정 후 정액에서 젤 같은 일관성을 변경 물, 프로세스 라는 액 화. 이 연구에서 우리는 마우스 모델에서 여성 재생산 지역에서 후 ejaculated 정액을 수집 하는 방법을 보여줍니다. 첫째, 성인 여성 쥐 발 정기 단계에서 남자의 감 금 소에 하룻밤 보관 되어 있었다. 다음날 아침, 결합 질에 copulatory 플러그의 존재에 의해 확인 됐다. 여성 쥐 copulatory 플러그와 안락사 했다 고 각 생식 관 (질, 자 궁, oviducts, 난소), 전체적으로 수집 된 정액을 포함 하는 닫힌된 시스템을 보장. 튜브에 정액을 풀어 질 렸와 생식로 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 배치 되었다. 분석에 대 한 최대 정액 볼륨을 보장 하기 위해, 한적한 집게는 나머지 정액을 추방 하는 질 끝에 난소에서 자 궁 뿔을 집어넣은 사용 되었다. 전체 생식 관은 다음 삭제 됩니다. 정액에 포함 된 튜브는 잠시 내려 냈 지. 25 μ 모 세관 피 펫 (튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 튜브에 배치 했다. 25 μ 라인에 모 세관 튜브를 작성 하는 데 사용 하는 시간을 기록 했다. 검증 된 남성 종 축에서 정액은 일반적으로 25 μ 모 세관 튜브를 채우기 위해 약 60-180 s를 걸립니다. 이 정액 컬렉션 기술은 또한 정자 이미징 및 운동 성 분석 등 다른 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
Introduction
여성 재생산 지역 상위 및 하위 책자의 구성 됩니다. 위 재생산 지역에는 나 팔 관, 자 궁 그리고 endocervix는 포함 되어 있습니다. 낮은 재생산 지역에는 ectocervix 및 질 포함 됩니다. 인간에서는, ejaculated 정액 ectocervix1에 인접 한 질 앞쪽 벽에 입금 됩니다. 그러나 쥐,, 정액은 휩 쓸 자 궁으로2짝짓기 후 분 이내.
정액 침투 수를 정자를 일으키는 루의 초 이내에 경화 되 고3움직일 정액 젤을 포함 합니다. 액 화 물 일관성에 젤 같은에서 정액을 변경 하 여 고정된 정자를 해제 합니다. 이 과정은 정자의 운동 성 및 포유류 복제에 대 한 필수적입니다. 정액 액 화의 지식은 주로 어디 정액 문화 접시에 액 화 된다 생체 외에서 연구 기반으로 합니다. 인간에서는, 전립선 특정 항 원 또는 PSA (일컬어 kallikrein 관련 peptidase 3 또는 KLK3)의 효소 활동은 semenogelins (젤 형성 단백질 정액에 존재)4 의 가수분해를 통해 액 화에 대 한 주요 기여자 ,56. Semenogelins의 정자 이동성 증가 정액 coagulum에서 정자를 줘 라. 계란을 기름 지 게 나 팔 관으로 정자 수영을 해제. 액 화 (또는 정액 점도) 테스트는 불 임 클리닉 남성 불 임7평가에서 정액 분석을 위한 표준 초기 검 진 중 하나.
최근에 출판 된 기사를 정액 액체 여성 마우스 생식 관 후 짝짓기에서 수집 된의 분석 이후에 다 산 결함8를 일으킬 수 있는 액 화 결핍을 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 결함이 액 정액 hyperviscosity 같은 남자9, 일반 액 화는 포유류 복제를 위한 불가결 제안에 불 임 사례의 11.8 32.3%에 기여 한다. 그러나, 연구 및 치료 액 결함의 남성7에 독점적으로 집중 했다. 여성 재생산 지역 정액 액 화에서 역할을 담당 하는 가능성은 탐구 하지. 따라서, 정액 수집 및 액 화 시간 측정 방법 연구 액 관심의 모델 생물에서 불 임의 원인 중 하나 될 수 있는지 여부를 결정 하는 새로운 진단 도구를 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
같이 전 수 정액 및 여성 재생산 지역. 에서 분 비 물 간의 생리 적인 상호 작용 정액 분석에서 생체 외에서 이점을 제공할 수 있습니다 마우스 uteri에서 정액을 수집 이 연구에서 제시 하는 기술 연구원 정액 품질과 정자 생존으로 이상적인 생리 조건에서 운동 성을 확인 하 수 있습니다. 또한, 정액은 uteri에서 수집 된를 사용 하 여 수행할 수 있는 다양 한 다운스트림 분석, 예를 들어 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 ww 수의학 대학 (WSU) 시작 기금에 의해 지원 됩니다. 저자는이 논문의 중요 한 독서에 대 한 시에라 올 슨 (WSU) 감사합니다.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
