脳における遺伝子の細胞の自律的機能損失を誘導することによって学ぶことができるまたは細胞のまばらな人口の機能を得る。ここでは、関数の vivoの損失を引き起こす floxed の遺伝子を持つ皮質ニューロンの開発のまばらな人口に Cre リコンビナーゼを提供する子宮内エレクトロポレーションについて述べる。
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方法論記事
子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
遺伝子の細胞自律神経機能の損失を引き起こすことによって明らかになることやニューロンの小さく、まばらな人口の遺伝子の機能を得る。そうニューロンの損失または遺伝子の機能のゲインが遺伝的摂動組織に囲まれているモザイクを生成する必要があります。ここでは、我々 はニューロンの遺伝子の細胞の自律的機能を研究するために使用できるモザイク脳組織を生成するために子宮内でエレクトロポレーションと Cre lox 組換えシステムを組み合わせます。DNA コンストラクト (リポジトリを通じて利用可能)、蛍光ラベルと Cre リコンビナーゼのコーディングが両脇に loxP サイトで子宮を用いたマウス胚の脳における遺伝子を含む皮質ニューロンの開発に導入します。エレクトロポレーション。さらに、子宮内でエレクトロポレーション法の存続性と再現性を向上させる様々 な適応について述べる。このメソッドはまた、ニューロンのスパースまたは密な人口の Cre 介する組み換え価を確立します。ラベル付けされた脳組織の組織学的準備を必要としない (しかしに合わせることができる) の免疫組織化学。使用構造を保証する蛍光ニューロン キャリー Cre リコンビナーゼの遺伝子に分類します。組織学的準備は、アーバーの樹状突起と軸索と樹状突起スパインの共焦点イメージングによるニューロンの形態素解析を許可します。損失または利得関数のスパース モザイク組織で実現するため、このメソッドは、遺伝子製品生体内での細胞の自律的必要性の検討とを許可します。
概要
興味の遺伝子の機能を理解するための古典的な実験パラダイムは、遺伝のモザイクを生成します。遺伝子は細胞の表現型に必要なかどうかを決定するには、最も簡単な方法は有機体 (例えばノックアウト) を通して遺伝子の機能の損失を引き起こしています。ただし、遺伝子が特定の細胞型で特に必要なかどうかを決定、生物全体の遺伝子のノックアウトは有効なアプローチではありません。代わりに、メソッドが必要なしの野生型 (すなわち遺伝的摂動) 組織に囲まれている間特定のセルに遺伝子の機能の損失と、-つまり、モザイク組織を作成します。突然変異体の細胞が突然変異体の表現型を示していますが、周囲の野生型細胞は、細胞自律的方法で遺伝子機能。解析モザイク組織、変異細胞が野生型組織に囲まれているは、遺伝子、特にニューロンとグリア細胞が組織の広大な相互接続ネットワークを形成する脳の細胞の自律的機能の理解に最適です。
モザイク脳組織のいくつかのフォームは、遺伝子の細胞の自律的機能を調べるための強力なモデルを提供しています。神経移植1、女性 X-リンクされてモザイク2,3,4に焦点を当てた研究とモザイクに基づいて彼らの結論を描画している内因性の体細胞モザイ....
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プロトコル
ここで説明する方法は、やすべての関連する規制・制度のガイドラインの遵守動物ケアおよび使用委員会 (ACUC) のジェームズ ・ マディソン大学によって承認されています。
1. マウスのセットアップ
- 若者の家 (> P60) ブリーダー ペア25を設定する一緒に男性と女性のホモ floxed マウス。
注: 良いネガティブ コントロールする Cre リコンビナーゼ式ないがモザイク26野生型マウスの追加ブリーダー ペアを設定することです。 - 出産する男性と彼女の最初のごみを発生させる女性を許可します。ごみの生存を増加する女性と男性を維持します。例えば生後日 (P) 21、ごみを離乳後別の女性と男性。
-
マウスの繁殖
- 男女25の間でタイミング合うを設定します。視覚的な合図を使用して、女性27, 発情周期を判断して交尾25後朝膣にプラグをチェックします。
- プラグインが見つからない場合、分離し、女性の重量を量る。(E) 0.5 日と日をカウントします。
- 引き続き女性すべての....
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結果
シングルは、GFP を構築します。Cre は E15.5 で electroporated をされ、P14 の可視化 (材料の一覧を参照してください)。コンストラクトの濃度や注入量、に応じてスパースまたは高密度の結果22,26を取得できます。たとえば、2 mg/mL GFP の 1 μ l 注入。明るい (図 1 a)、および、ローカライズされた層 II/III (図 1 b) をすることができますいくつかのラベル付きセルの希薄な分布で Cre の結果。組織が 100 μ m 厚には、樹状のアーバーのほとんどは (図 1) が保持されます。高倍率 (60 X での樹状突起棘を観察できます。図 1)。同じ濃度で 1.5 μ.......
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ディスカッション
モザイク脳組織を生成する floxed マウスにおける Cre リコンビナーゼとエレクトロポレーションの子宮内の組み合わせを紹介します。このアプローチの利点は、新しいマウス行が異なる細胞サブタイプが対象とするたびに生成する必要はありません: 興奮性ニューロン、抑制ニューロンまたは時間によってグリア細胞を対象に子宮内でエレクトロポレーションを使用できますエレクトロポレーション15,16,17,18,19,20,21,34のと場所。我々 のアプローチで大脳皮質をターゲットが一貫.......
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開示事項
著者はある利益相反を開示します。
謝辞
著者らは、ジェームズ ・ マディソン大学生物教室・ ジェームズ ・ マディソン大学光顕微鏡イメージング施設の寛大なサポートをありがとうございます。夫妻ジャスティン ・ w ・ ブラウンとコーリー ・ l ・ クレランド手術材料と空間の寛大な調整のために博士マーク ・ l ・ ガブリエレ若い生後ティッシュの準備、に関する有益な助言を。この研究はだった 4-バージニア州、連邦のバージニア州 (G.S.V.) を推進するための共同パートナーシップとによってバージニア州アカデミーの科学小プロジェクト研究助成金 (G.S.V.) 共同研究助成金によって一部で賄われて。学部研究生奨学金 (K.M.B.) に、ファレル夏研究奨学金 (K.M.B.) をジェームズ ・ マディソン大学第 2 世紀への奨学金 (K.M.B.)、寛大サポート ベティ Jo 愛するバトラー 58年基金によって提供されているジェームズマディソン大学百周年記念奨学金 (C.J.H.) に、ジェームズ ・ マディスン大学ルーシー ロビンソン検索 30年記念奨学金 (Z.L.H.) に、科学と数学教員援助交付金 (G.S.V.) にジェームズ ・ マディソン大学。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| C57BL/6Jマウス | ジャクソン研究所 | #000664 | 「1.マウスのセットアップ」(ステップ1.1「野生型マウス」) |
| GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | 「2.DNAセットアップ」(ステップ2.1「Creリコンビナーゼと蛍光マーカーをコードする単一のDNAコンストラクト」)。GFPです。Cre empty vectorはTyler Jacksからの贈り物でした。 |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | 「2.DNAセットアップ」(ステップ2.1「超新星」システム)と http://snsupport.webcrow.jp/。pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) は、岩里卓司さんからのプレゼントでした。 |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | 「2.DNAセットアップ」(ステップ2.1「超新星」システム)と http://snsupport.webcrow.jp/。pK031.TRE-Cre (Supernova) は岩里卓司さんからのプレゼントでした。 |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (超新星) | AddGene | #85006 | 「2.DNAセットアップ」(ステップ2.1「超新星」システム)と http://snsupport.webcrow.jp/。pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) は、岩里卓司さんからのプレゼントでした。 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | 「2.DNAセットアップ」(ステップ2.3「エンドトキシンフリープラスミド精製キット」) |
| トリパンブルーパウダー、バイオ試薬グレード | Sigma | T6146-5G | 「2.DNAセットアップ」(ステップ2.5「トリパンブルー」) |
| 塩化ナトリウム、ACS、2.5kgVWR | BDH9286-2.5KG | 「2.DNA setup-up" (step 2.5 "NaCl") | |
| 塩化カリウム、ACS、500 g | VWR | #97061-566 | 「2.DNAセットアップ」(ステップ2.5「KCl」) |
| リン酸二塩基性ナトリウム、ReagentPlus、100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | 「2.DNA setup-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
| リン酸カリウム一塩基性、ReagentPlus、100g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | 「2.DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
| 塩酸、ACS試薬、500mL | Fisher Scientific | A144-500 | 「2.DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
| P-97 マイクロピペットプーラー | サッター器具 | P-97 | 「3.ピペットセットアップ」(ステップ3.1「ガラスキャピラリープーラー」) |
| 3.0mm幅トラフフィラメント | サッターインストゥルメント | FT330B | 「3.「ピペットのセットアップ」(ステップ3.1「ガラスキャピラリープーラー」) |
| 薄肉ガラスキャピラリー、4インチ、1 / 0.75 OD / ID | World Precision Instruments | TW100-4 | 「3.ピペットのセットアップ」 (ステップ3.1.1「ガラスキャピラリー」) |
| 単層ソフトテックワイプ、4.5インチ | フェニックス | LW-8148 | 「3.ピペットのセットアップ」(ステップ3.2.1「単層タスクワイプ」);他の単層ワイプ(キムワイプなど)も使用できます。 |
| Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | 「4.In Utero electroporation" (step 4.1 "Graefe Forceps") |
| Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | 「4.In Utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
| Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「ハートマン蚊鉗子」) |
| 汎用不織布スポンジ、2インチ×2インチ、4層 | Medrepexpress | #2204-c | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「不織布ガーゼスポンジ」) |
| リング先端鉗子、10cm、ストレート、内径2.2mm | World Precision Instruments | #503203 | 「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「リング先端鉗子」) |
| パイレックスペトリ皿が完成し、O.D. ×高さ100 mm&時間;20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | 「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「ペトリ皿」) |
| フラットタイプインスツルメントトレイ、ステンレス鋼、13-5/8インチ x 9-3/4インチ x 5/8インチ | アマゾン | B007SHGAHA | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「ステンレス製トレー」) |
| プラチナピンセット、5mm | BTX | #45-0489 | 「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.3および4.16「ピンセット型電極」) |
| ECM 830フットペダル | BTX | #45-0211 | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.3および4.17「フットペダル」) |
| ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | 「4.In Utero Electroporation" (step 4.3 "generator") |
| Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.4および4.6「ノーズコーン」、ステップ4.4「誘導室」) |
| 眼科用軟膏 | ハンナファーマシューティカルサプライCo | #0536108691 | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.7「獣医眼軟膏」) |
| Space Gel(AIMS) | VWR | #95059-640 | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.8「過飽和塩溶液を充填した密封パウチ」) |
| 脱毛ジェルクリーム、センシティブフォーミュラ | Veet | #062200809951 | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.9「脱毛クリーム」) |
| 10ul ローリテンションチップスターター(960チップ/パック) | フェニックスリサーチプロダクツ | TSP-10LKIT | 「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.12「滅菌10µLマイクロピペットチップ") |
| 校正済みマイクロキャピラリーピペット用アスピレーターチューブアセンブリ | Sigma-Aldrich | A5177 | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.15「吸引器チューブアセンブリ」)は |
| 、編組吸収性縫合糸、4-0、ニードルNFS-2(FS-2)、27インチ | 「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.19「吸収性縫合糸」) | ||
| 」リキベットラピッド」ティッシュ接着剤 | Medrepexpress | VG3 | 「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.20「ティッシュ接着剤」) |
| 下注射器、ポリプロピレン、ルアーロックチップ、容量1.0mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | 「4.In Utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
| BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | 「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.21 "26G、½”needle") |
| ネスレネスティングマテリアル | Ancare | NES3600 | 「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.24「ネスティング材料」) |
| ヒマワリの種、ブラックオイル、滅菌 | バイオサーブ | S5137 | 「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.24「ヒマワリの種」) |
| パラホルムアルデヒド、97% | アルファAesar | A11313 | 「5.Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
| エコノミーピンセット #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | 「5.「組織学」(ステップ5.5「ピンセット」) |
| 寒天粉末 | Alfa Aesar | #10752 | 「5.組織学」(ステップ5.8.1「寒天」) |
| 片刃カミソリ刃、#9刃 | レーツール | #11-515 | 「5.「組織学」(ステップ5.9「片刃カミソリ刃」) |
| 標本ディスク S D 50mm | ライカ | #14046327404 | 「5.「組織学」(ステップ5.9「振動するミクロトーム標本ディスク」) |
| バッファートレイSアセンブリ | ライカ | #1404630132 | 「5.「組織学」(ステップ5.10「バッファートレイ」) |
| VT1000 S ビブレーターライ | カ | #14047235612 | 5.「組織学」(ステップ5.10「振動ミクロトーム」) |
| 両刃カミソリ刃ペル | ソナ | BP9020 | 「5.「組織学」(ステップ5.10「ブレード」) |
| ナイフホルダーS | カ | #14046230131 | 「5.「組織学」(ステップ5.10「ナイフホルダー」) |
| スタジオエレメンツゴールデンタクロンショートハンドルラウンドブラシセット | アマゾン | B0089KU6XE | 「5.Histology" (step 5.12.1 "fine tiped paintbrush") |
| Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | 「5.Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | 「5.「組織学」(ステップ5.12.3-5.12.4「封入剤」) |
| カバーガラス、24×50 mm、No.1 | フェニックス研究製品 | MS1415-10 | 「5.Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | 「5.組織学」(ステップ5.13.1「DAPI」) |
| 固定ステージ正立顕微鏡 | リンパス | BX51WI | 「5.「組織学」(ステップ5.15「光学顕微鏡」) |
| レーザー走査型共焦点顕微鏡 | ニコン | TE2000/C2Si | 「5.組織学」(ステップ5.15「共焦点顕微鏡」) |
| 4倍対物レンズ、NA=0.20 | コン | CFIプランアポラムダ4倍 | 「5.Histology」(ステップ5.15「低電力対物レンズ」) |
| 20倍対物レンズ、NA=0.75 | コン | CFIプランアポラムダ20倍 | 「5.Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
| 60x 対物レンズ、NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | 「5.組織学」(ステップ5.15「高倍率対物レンズ」) |
参考文献
- Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genot....
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