Ячейки автономных функций генов в мозге могут быть изучены, вызывая потери или получить функции в разреженных популяции клеток. Здесь мы описываем в утробе матери электропорации доставить рекомбиназа КРР в разреженных населения вызывают потери функции в vivoразвивающихся корковых нейронов с floxed генов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Вызывая Cre-lox рекомбинации в мыши головного мозга путем электропорации в утробе матери
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ячейки автономных функций нейронов генов могут быть выявлены, вызывая потери или получить функции гена в небольшой и редкие популяции нейронов. Для этого требуется создание мозаику, в которой нейроны с прибылей или убытков функции гена окружены генетически невозмущенной ткани. Здесь мы сочетаем системе рекомбинации Cre-lox с электропорации в утробе матери для того, чтобы генерировать ткани мозга мозаики, которые могут быть использованы для изучения клеток автономные функции генов в нейронах. ДНК конструкции (доступно через репозитории), кодирование для флуоресцентные метки и Cre рекомбиназа, вводятся в разработке корковых нейронов, содержащие гены с сайтов loxP в мозгах зародышей мыши, используя в утробе матери Электропорация. Кроме того мы описываем различные приспособления в метод электропорации в утробе матери , которые увеличивают выживаемость и воспроизводимость. Этот метод также включает установление титра для Cre опосредованной рекомбинации в разреженный или плотные популяции нейронов. Гистологические препараты помечены мозговой ткани не требуется (но могут быть адаптированы к) иммуногистохимия. Конструкции, используемые гарантируют что дневно помечены нейронов нести ген рекомбиназа Cre. Гистологические препараты позволяют морфологический анализ нейронов через конфокальная томография дендритных и аксональной беседки и дендритных шипиков. Потому что в разреженных мозаика ткани достигается прибылей или убытков функции, этот метод позволяет исследование клеток автономная необходимость и достаточность гена продуктов в естественных условиях.
Введение
Создание генетических мозаика — классический экспериментальная парадигма для понимания функции гена интереса. Чтобы определить, является ли необходимой для клеточном фенотипу ген, простейший подход вызывает потерю функции гена во всем организме (например , нокаут). Однако чтобы определить, если ген требуется конкретно определенного типа клеток, нокаут гена во всем организме не является допустимым подход. Вместо этого метода не требуется, приведет к потере функции гена в данной ячейке, в то время как он окружен ткани wildtype (т.е. генетически невозмущенной) — другими словами, создание мозаики тканей. Если мутант ячейки показывает мутант фенотип, но о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Описанные здесь методы были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) из Университета Джеймса Мэдисона и находятся в соответствии и соблюдение всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов.
1. мышь Set-up
- Дом молодой (> P60) Мужские и женские гомозиготных floxed мышь вместе, чтобы создать пару заводчик25.
Примечание: Хороший отрицательный контроль заключается в создании дополнительных заводчик пару мышей wildtype, в котором Cre рекомбиназа выражение не вызовет мозаика26. - Разрешить Самки рожают и поднять ее первый помет с мужчиной....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сингл построить GFP. CRE (см. перечень материалов) была electroporated на E15.5 и визуализированы на P14. В зависимости от концентрации конструкции и объем впрыска Разреженный или плотной результат можно получить22,26. Например внутримышечно по 1 мкл 2 мг/мл GFP. Результаты КРР в разреженных распределения помеченных клеток, некоторые из которых могут быть ярко (рис. 1A) и локализованных в слой II/III .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представляем сочетание в утробе матери электропорации с КРР рекомбиназа floxed мышей для создания мозаики мозговой ткани. Преимуществом этого подхода является, что новая линия мыши не нужно создаваться каждый раз разных клеточных подтип направлены: электропорация в утробе матери могут использоваться для целевой возбуждающих нейронов, ингибирующих нейронов и глии в зависимости от времени и расположение электропорации15,16,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Благодарности
Авторы благодарят щедрой поддержке Департамента биологии университета Джеймс Мэдисон и Джеймс Мэдисон университета свет микроскопии и визуализации объекта. Д-р Марк л Gabriele за полезные рекомендации относительно подготовки молодых послеродовой ткани, и Drs. Джастин Браун и Кори л Cleland щедрой координации хирургических материалов и пространства. Это исследование финансировалось частично совместный исследовательский грант 4-ва, партнерством для продвижения Содружества Вирджинии (G.S.V.) и по Вирджинии Академии от науки малых проекта исследовательский грант (G.S.V.). Поддержка была щедро предоставляемые Бетти Джо любящий Батлер ' 58 пожертвований для....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J мыши | Лаборатория Джексона | #000664 | См. "1. Настройка мыши" (шаг 1.1, "мыши дикого типа") |
| GFP. Cre пустой вектор | AddGene | #20781 | См. "2. Настройка ДНК» (шаг 2.1 «Единая конструкция ДНК, которая кодирует Cre-рекомбиназу, а также флуоресцентный маркер»). GFP. Cre пустой вектор был подарком от Тайлера Джекса. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | См. "2. DNA setup" (шаг 2.1 "система "Supernova") и http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) был подарком от Такудзи Ивасато. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | См. "2. DNA setup" (шаг 2.1 "система "Supernova") и http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Сверхновая) была подарком от Такудзи Ивасато. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | См. "2. DNA setup" (шаг 2.1 "система "Supernova") и http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) был подарком от Такудзи Ивасато. |
| Набор EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | См. "2. ДНК-установка» (шаг 2.3 «набор для очистки плазмид без эндотоксинов») |
| Порошок трипанового синего цвета, биореагент марки | Sigma | T6146-5G | См. «2. Настройка ДНК" (шаг 2.5 "трипановый синий") |
| Хлорид натрия, ACS, 2,5 кг | VWR | BDH9286-2,5 кг | См. "2. Настройка ДНК" (шаг 2.5 "NaCl") |
| Хлорид калия, ACS, 500 г | VWR | #97061-566 | См. "2. ДНК-установка" (шаг 2,5 "KCl") |
| Натрия фосфат двухосновный, ReagentPlus, 100 г | Sigma-Aldrich | S0876-100G | См. "2. ДНК" (шаг 2.5 "Na2HPO4") |
| Фосфат калия моноосновный, ReagentPlus, 100 г | Sigma-Aldrich | P5379-100G | См. "2. Настройка ДНК" (шаг 2,5 "KH2PO4") |
| Соляная кислота, реагент ACS, 500 мл | Fisher Scientific | A144-500 | См. "2. Настройка ДНК" (шаг 2.5 "HCl") |
| P-97 Съемник микропипеток | Sutter Instrument | P-97 | См. "3. Настройка пипетки" (шаг 3.1 "стеклянный капиллярный съемник")Желоб |
| шириной 3,0 мм нить | Sutter Instrument | FT330B | См. "3. Настройка пипетки" (шаг 3.1 "Съемник стеклянных капилляров") |
| Тонкостенные стеклянные капилляры, 4", 1 / 0,75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | См. "3. Настройка пипетки" (шаг 3.1.1 "стеклянный капилляр") |
| Однослойные салфетки Soft-Tech, 4,5 " | Phenix | LW-8148 | См. "3. Настройка пипетки» (шаг 3.2.1 «однослойная рабочая протирка»); можно использовать другие однослойные салфетки (например, Kimwipes). |
| Щипцы Грефе, 7 см, прямые, 0,7 мм 1x2 зубья | World Precision Instruments | #14140 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Щипцы Грефе") |
| Ножницы с диафрагмой, 11,5 см, прямые, 12 упаковок | World Precision Instruments | #503708-12 | Смотрите "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Ножницы для радужной оболочки") |
| Hartman Mosquito Щипцы, 9 см, прямой, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Москитные щипцы Хартмана") |
| Губки общего назначения нетканые губки, 2" x 2", 4-слойный | Medrepexpress | #2204-c | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Нетканые марлевые губки") |
| Щипцы с кольцевым наконечником, 10 см, прямые, 2,2 мм ID | World Precision Instruments | #503203 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "щипцы с кольцевым наконечником") |
| Чашки Pyrex petri в комплекте, O.D. × В 100 мм и раз; 20 мм | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "Чашки Петри") |
| Плоский поднос для инструментов, нержавеющая сталь, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.1 "поднос из нержавеющей стали") |
| Платиновый твицертрод, 5 мм | BTX | #45-0489 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.3 и 4.16 "электроды типа пинцера") |
| ECM 830 Ножная педаль | BTX | #45-0211 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.3 и 4.17 "ножная педаль") |
| ECM 830 Генератор | BTX | #45-0052 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.3 "генератор") |
| Система анестезии изофлураном для одного животного с малым индукционным | боксом Harvard Apparatus | #72-6468 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.4 и 4.6 "носовой конус", шаг 4.4 "индукционная камера") |
| Офтальмологическая мазь | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.7 "ветеринарная офтальмологическая мазь") |
| Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.8 "Запечатанный мешочек заполнен перенасыщенным солевым раствором") |
| Гель-крем для снятия волос, формула для чувствительных | Veet | #062200809951 | Смотрите "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.9 "крем для депиляции") |
| 10 мкл Low Retention Tip Starter (960 наконечников/шт) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.12 "стерильные 10&микро; L наконечник для микропипетки") |
| Аспираторные трубки в сборе для калиброванных микрокапиллярных пипеток | Sigma-Aldrich | A5177 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.15 "Сборка аспираторной трубки") |
| Плетеный рассасывающийся шовный материал, 4-0, игла NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.19 "Рассасывающиеся швы") |
| " ЛиквиВет Рапид» Тканевый клей | Медрепэкспресс | ВГ3 | см. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.20 "тканевый клей") |
| Шприцы для подкожных инъекций, полипропилен, наконечник замка Люэра, емкость 1,0 мл | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | См. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.21 "Шприц 1 мл")BD |
| Precisionglide шприц с иглами калибра 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | см. "4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.21 "26G, ½ ” игла") |
| Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | см. "4. Внутриутробная электропорация» (шаг 4.24 «Материалы для гнездования») |
| Семена подсолнечника, черное масло, стерильный | Bio-Serv | S5137 | См. «4. Внутриутробная электропорация" (шаг 4.24 "Семена подсолнечника") |
| Параформальдегид, 97% | Альфа Аэсар А11313 | См. "5. Гистология" (шаг 5.1.1 "PFA") | |
| Экономичный пинцет #3, 11 см, наконечники 0,2 x 0,4 мм | World Precision Instruments | #501976 | См. "5. Гистология" (шаг 5.5 "пинцет") |
| Порошок агара | Alfa Aesar | #10752 | См. "5. Гистология" (шаг 5.8.1 "агар")Лезвия |
| бритвы с одним лезвием, лезвие #9 | Stanley Tools | #11-515 | См. "5. Гистология" (шаг 5.9 "лезвие бритвы с одним лезвием") |
| Диск для образцов S D 50 мм | Leica | #14046327404 | См. "5. Гистология" (шаг 5.9 "вибрирующий микротомный диск для образцов") |
| Буферный лоток S сборка | Leica | #1404630132 | См. "5. Гистология" (шаг 5.10 "буферный лоток") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | См. "5. Гистология" (шаг 5.10 "Вибрационный микротом") |
| Лезвия бритвы с двойным лезвием | Personna | BP9020 | см. "5. Гистология" (шаг 5.10 "лезвие")Держатель |
| ножа S | Leica | #14046230131 | См. "5. Гистология" (шаг 5.10 "держатель ножа") |
| Studio Elements Golden Taklon с короткой ручкой, круглая щетка, набор | B0089KU6XE | см. "5. Гистология" (шаг 5.12.1 "кисть с тонким кончиком") | |
| Superfrost Plus Slides | Услуги электронной микроскопии | #71869-11 | См. "5. Гистология" (шаг 5.12.1 "предметное стекло микроскопа") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 мл | Thermofisher | P36970 | См. "5. Гистология" (шаг 5.12.3-5.12.4 "монтант") |
| Покровное стекло, 24 x 50 мм, No 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | См. "5. Гистология" (шаг 5.12.4 "покровное стекло") |
| 4′,6-Диамидино-2-фенилиндола дигидрохлорид (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | См. "5. Гистология" (шаг 5.13.1 "DAPI")Стационарный |
| вертикальный микроскоп | Olympus | BX51WI | см. "5. Гистология" (шаг 5.15 "световой микроскоп") |
| Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп | Nikon | TE2000/C2si | см. "5. Гистология" (шаг 5.15 "конфокальный микроскоп")4x |
| объектив, NA = 0.20 | Nikon CFI Plan Apo Lambda | 4X См. "5. Гистология" (шаг 5.15 "маломощный объектив") | |
| объектив 20x, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | См. "5. Гистология" (шаг 5.15 "объектив средней мощности") |
| объектив 60x, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | См. "5. Гистология» (шаг 5.15 «объектив высокой мощности») |
Ссылки
- Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genot....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
