Funciones célula Autónoma de genes en el cerebro pueden ser estudiadas mediante la inducción de la pérdida o ganan de función en poblaciones dispersas de las células. Aquí, describimos en el útero la electroporación para entregar recombinase de Cre en poblaciones escasas de desarrollo de las neuronas corticales con genes floxed a causar la pérdida de función en vivo.
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Artículo de método
Inducción de la recombinación del Cre-lox en la corteza Cerebral de ratón a través de electroporación en el útero
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Resumen
Resumen
Funciones neuronales células autónomas de genes pueden ser reveladas por una pérdida o ganan de función de un gen en una población pequeña y escasa de neuronas. Para ello requiere generar un mosaico en que las neuronas con la pérdida o ganancia de función de un gen están rodeadas por tejido genéticamente imperturbable. Aquí combinamos el sistema de recombinación del Cre-lox con electroporación en el útero con el fin de generar el tejido de cerebro de mosaico que se puede utilizar para estudiar la función celular Autónoma de genes en las neuronas. Construcciones de ADN (disponibles en repositorios), codificación para una etiqueta fluorescente y recombinase de Cre, se introducen en el desarrollo de las neuronas corticales que contienen genes flanqueados con sitios loxP en los cerebros de embriones de ratón con el útero en electroporación. Asimismo, describen varias adaptaciones para el método de electroporación en el útero que aumentan la supervivencia y reproducción. Este método también implica establecer un título para la recombinación mediada por la Cre en una población densa o escasa de neuronas. Preparaciones histológicas de tejido cerebral marcada no requieren (pero puede ser adaptadas a) immunohistochemistry. Los constructos utilizados garantizan que etiqueta fluorescente las neuronas llevan el gen del recombinase de Cre. Preparaciones histológicas permiten análisis morfológico de neuronas a través de la proyección de imagen confocal de cenadores dendríticas y axonales y espinas dendríticas. Debido a la pérdida o ganancia de función se realiza en tejido mosaico escaso, este método permite el estudio de la célula autónoma necesidad y suficiencia de productos gen en vivo.
Introducción
La generación de un mosaico genético, es un paradigma experimental clásico para entender la función de un gen de interés. Para determinar si un gen es necesario para un fenotipo celular, el enfoque más sencillo está causando una pérdida de función del gen en el organismo (por ejemplo, knockout). Sin embargo, para determinar si un gen se requiere específicamente en un determinado tipo de célula, golpe de gracia del gene en el organismo no es un enfoque válido. En cambio, se requiere un método que causará la pérdida de función de un gen en una célula determinada, mientras que está rodeado por tejido de tipo salvaje (es decir, genéticamente imperturbabl....
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Protocolo
Métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y uso Comité (ACUC) de la Universidad James Madison y están de acuerdo y conformidad con todas las directrices pertinentes del reguladoras e institucionales.
1. configuración del ratón
- Casa de un joven (> P60) ratón macho y hembra homocigótica floxed para establecer un criador par25.
Nota: Un buen control negativo consiste en establecer un par adicional de criador de ratones de tipo salvaje, que Cre expresión recombinase no hará un mosaico26. - Permitir a la hembra parir y criar su primera camada con el varón.....
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Resultados
La sola construcción GFP. CRE (véase lista de materiales) fue electroporated en E15.5 y visualizados en P14. Dependiendo de la concentración de la construcción y el volumen de la inyección, puede obtenerse un resultado escaso o densa22,26. Por ejemplo, la inyección de 1 μl de 2 mg/mL GFP. Resultados CRE en una escasa distribución de las células marcadas, algunas de las cuales pueden ser brillante (figura 1A
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Discusión
Aquí, presentamos la combinación de la electroporación en el útero con recombinase de Cre en los ratones de floxed para generar el tejido del cerebro de mosaico. Una ventaja de este enfoque es que una nueva línea de mouse no es necesario que se generan cada vez un diferente subtipo celular debe orientarse: electroporación en el útero puede utilizarse para apuntar neuronas excitatorias, las neuronas inhibitorias o glia dependiendo de la época y la ubicación de electroporación15
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo generoso de la James Madison University Departamento de biología y la James Madison University microscopía de luz y centro de la proyección de imagen. Dr. Mark L. Gabriele para consejos útiles con respecto a la preparación de jóvenes tejido postnatal, y DRS. Justin W. Brown y Corey L. Cleland generoso coordinación de espacio y materiales quirúrgicos. Esta investigación fue financiada en parte por una beca de investigación colaborativa 4-VA, una colaboración para el avance de la Commonwealth de Virginia (G.S.V.) y por Virginia Academia de ciencia pequeño proyecto de investigación becado (G.S.V.). Se ha generosamente apoya....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones C57BL/6J | El Laboratorio Jackson | #000664 | Ver "1. Configuración del ratón" (paso 1.1, "ratones de tipo salvaje") |
| GFP. Cre vector vacío | AddGene | #20781 | Véase "2. Configuración del ADN" (paso 2.1: "construcción de ADN única que codifica para la recombinasa Cre, así como un marcador fluorescente"). GFP. El vector vacío Cre fue un regalo de Tyler Jacks. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | Véase "2. Configuración del ADN" (paso 2.1 Sistema "Supernova") y http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) fue un regalo de Takuji Iwasato. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | Véase "2. Configuración del ADN" (paso 2.1 Sistema "Supernova") y http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) fue un regalo de Takuji Iwasato. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | Véase "2. Configuración del ADN" (paso 2.1 Sistema "Supernova") y http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) fue un regalo de Takuji Iwasato. |
| Kit Maxi de Plásmido EndoFree (10) | Qiagen | #12362 | Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.3 "kit de purificación de plásmidos sin endotoxinas") |
| Polvo de azul de tripano, grado de biorreactivo | Sigma | T6146-5G | Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "azul de tripano") |
| Cloruro de sodio, ACS, 2,5 kg | VWR | BDH9286-2,5KG | Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "NaCl") |
| Cloruro de potasio, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "KCl") |
| Fosfato de sodio dibásico, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "Na2HPO4") |
| Fosfato de potasio monobásico, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "KH2PO4") |
| Ácido clorhídrico, reactivo ACS, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | Ver "2. Configuración del ADN" (paso 2.5 "HCl") |
| P-97 Extractor de micropipetas | Instrumento Sutter | P-97 | Ver "3. Configuración de la pipeta" (paso 3.1 "Tirador capilar de vidrio") |
| Filamento de canal de 3,0 mm de ancho | Instrumento Sutter | FT330B | Ver "3. Configuración de pipetas" (paso 3.1 "Extractor de capilares de vidrio") |
| Capilares de vidrio de pared delgada, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | Ver "3. Configuración de pipetas" (paso 3.1.1 "capilar de vidrio") |
| Toallitas de tecnología blanda de una sola capa, 4.5" | Phenix | LW-8148 | Ver "3. Configuración de pipetas" (paso 3.2.1 "toallita de tareas de una sola capa"); se pueden utilizar otras toallitas de una sola capa (por ejemplo, Kimwipes). |
| Pinzas Graefe, 7 cm, rectas, 0,7 mm 1x2 dientes | Precision Instruments | #14140 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Pinzas de Graefe") |
| Tijeras de iris, 11,5 cm, rectas, paquete de 12 | World Precision Instruments | #503708-12 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Tijeras de iris") |
| Pinzas para mosquitos Hartman, 9 cm, rectas, paquete de 12 | World Precision Instruments | #503728-12 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Pinzas para mosquitos Hartman") |
| Esponjas no tejidas de uso general, 2" x 2", 4 capas | Medrepexpress | #2204-c | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Esponjas de gasa no tejidas") |
| Pinzas con punta de anillo, 10 cm, rectas, 2,2 mm ID | World Precision Instruments | #503203 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "pinzas con punta anular") |
| Placas de Petri Pyrex completas, D.O. y tiempos; H 100 mm y veces; 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "Placas de Petri") |
| Bandeja de instrumentos de tipo plano, acero inoxidable, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.1 "bandeja de acero inoxidable") |
| Pinza de platino, 5 mm | BTX | #45-0489 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.3 y 4.16 "electrodos tipo pinza") |
| ECM 830 Pedal | BTX | #45-0211 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.3 y 4.17 "pedal") |
| ECM 830 Generador | BTX | #45-0052 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.3 "generador") |
| Sistema de anestesia de isoflurano para un solo animal con caja de inducción pequeña | Aparato de Harvard | #72-6468 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.4 y 4.6 "cono de nariz", paso 4.4 "cámara de inducción") |
| Pomada oftálmica | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | Ver "4. Electroporación intrauterina" (paso 4.7 "Pomada oftálmica veterinaria") |
| Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.8 "bolsa sellada llena de solución salina sobresaturada") |
| Crema Gel Depiladora, Fórmula Sensible | Veet | #062200809951 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.9 "Crema depilatoria") |
| 10ul Arrancador de punta de baja retención (960 puntas/paquete) | Productos de investigación | Phenix TSP-10LKIT | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.12 "estéril 10 y micro; L punta de micropipeta") |
| Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas | Sigma-Aldrich | A5177 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.15 "Conjunto del tubo aspirador") |
| Sutura reabsorbible trenzada, 4-0, Aguja NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.19 "suturas reabsorbibles") |
| " LiquiVet Rápido" Adhesivo para tejidos | Medrepexpress | VG3 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.20 "adhesivo tisular") |
| Jeringas hipodérmicas, polipropileno, punta Luer lock, capacidad 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.21 "Jeringa de 1 mL") |
| Agujas de jeringa BD Precisionglide calibre 26, L 1/2 pulg. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | Véase "4. Electroporación en el útero" (paso 4.21 "26G, ½ ” aguja") |
| Nestlets Material de anidación | Ancare NES3600 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.24 "Materiales de anidación") | |
| Semillas de girasol, aceite negro, | estéril Bio-Serv | S5137 | Ver "4. Electroporación en el útero" (paso 4.24 "semillas de girasol") |
| Paraformaldehído, 97% | Alfa Aesar | A11313 | Ver "5. Histología" (paso 5.1.1 "PFA") |
| Economía Pinzas #3, 11 cm, puntas de 0,2 x 0,4 mm | World Precision Instruments | #501976 | Ver "5. Histología" (paso 5.5 "pinzas") |
| Agar polvo | Alfa Aesar | #10752 | Ver "5. Histología" (paso 5.8.1 "agar") |
| Hojas de afeitar de un solo filo, hoja #9 Stanley | Tools | #11-515 | Ver "5. Histología" (paso 5.9 "cuchilla de afeitar de un solo filo") |
| Disco de muestras S D 50 mm | Leica | #14046327404 | Ver "5. Histología" (paso 5.9 "Disco de muestra de micrótomo vibratorio") |
| Bandeja tampón S montaje | Leica | #1404630132 | Ver "5. Histología" (paso 5.10 "bandeja tampón") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | Ver "5. Histología" (paso 5.10 "micrótomo vibratorio") |
| Hojas de afeitar de doble filo | Personna | BP9020 | Ver "5. Histología" (paso 5.10 "hoja") |
| Portacuchillos S | Leica | #14046230131 | Ver "5. Histología" (paso 5.10 "portacuchillos") |
| Studio Elements Golden Taklon Mango Corto Juego de Pinceles Redondos | Amazon B0089KU6XE | Ver "5. Histología" (paso 5.12.1 "pincel de punta fina") | |
| Superfrost Plus Slides Servicios de | Microscopía Electrónica | #71869-11 | Ver "5. Histología" (paso 5.12.1 "portaobjetos de microscopio") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | Ver "5. Histología" (paso 5.12.3-5.12.4 "montaje") |
| Cubreobjetos, 24 x 50 mm, n.º 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | Ver "5. Histología" (paso 5.12.4 "cubreobjetos") |
| 4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Ver "5. Histología" (paso 5.13.1 "DAPI") |
| Microscopio vertical de platina fija | Olympus | BX51WI | Ver "5. Histología" (paso 5.15 "Microscopio óptico") |
| Microscopio confocal de barrido láser | Nikon | TE2000/C2si | Ver "5. Histología" (paso 5.15 "microscopio confocal") |
| 4x objetivo, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | Ver "5. Histología" (paso 5.15 "objetivo de baja potencia") |
| objetivo 20x, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | Ver "5. Histología" (paso 5.15 "objetivo de potencia media") |
| Objetivo 60x, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Aceite | Ver "5. Histología" (paso 5.15 "objetivo de alta potencia") |
Referencias
- Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genot....
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Reimpresiones y permisos
