Auditiv hjärnstammen svar och yttre hår Cell hela-cell Patch Clamp inspelning i Postnatal råttor
Summary
Det här protokollet beskriver metoder för att spela in auditiv hjärnstammen svaret från postnatal råttungar. För att undersöka funktionella utvecklingen av yttre hårceller, beskrivs experimentella förfarandet för hela-cell patch clamp inspelning i isolerade yttre hårceller steg för steg.
Abstract
Den yttre hår cellen är en av de två typerna av sensoriska hårcellerna i hörselsnäckan däggdjur. De ändrar sin cell längd med potential att förstärka svaga vibrationer av lågaktivt ljudsignal-receptorn. Morfologin och elektrofysiologiska boendet av yttre hårceller (OHCs) utvecklas i tidig postnatal ålder. Mognaden av yttre hår cell kan bidra till utvecklingen av hörselsystemet. OHCs utvecklingen är dock inte väl studerat. Detta är delvis på grund av svårigheten att mäta deras funktion av elektrofysiologiska tillvägagångssätt. Med syfte att utveckla en enkel metod för att lösa problemet ovan, beskriver här vi ett stegvisa protokoll för att studera funktionen av OHCs i akut dissocierade snäckan från postnatal råttor. Med den här metoden kan vi utvärdera cochlear svaret på ren ton stimuli och undersöka uttrycket nivå och funktion av den motoriska protein prestin i OHCs. Denna metod kan också användas för att undersöka de inre hårcellerna (IHCs).
Introduction
Två distinkta funktioner av cochlear sensoriska hårcellerna är väsentliga för däggdjur hörsel: mechanoelectric transduction (MET) och electromotility1,2. Av MET kanaler ligger i den hår bunten, IHCs (IHCs) och OHCs konvertera ljudvibration membran till potentiella förändringar, samt det elektriska signalerar av innerverade spiral ganglion nervceller. OHCs ändra deras cell längd med membranpotentialen och förstärker vibrationen av lågaktivt ljud. Denna verksamhet kallas electromotility härleds det motoriska protein prestin ligger i den laterala väggen i OHCs3.
I många arter, inklusive gnagare, är funktionen förhandlingen omogna i tidig postnatal epok4,5. Inga potentiella åtgärder som svar på ljudsignaler kunde upptäckas i den auditiva cortexen innan förhandlingen debut6,7. Utveckling av morfologi och funktion av snäckan har studerats allmänt i musen, gerbil och råtta4,5,8. Den mechanotransduction och electromotility av hårceller utvecklas också i den tidiga liv epok5.
För att utvärdera hörsel känsligheten hos råttor på olika postnatal ålder, har vi utvecklat en metod för auditiv hjärnstammen svar (ABR) inspelning hos råttungar. Hela-cell patch clamp är en idealisk teknik att undersöka OHCs elektrofysiologiskt. Men begränsat jämfört med den patch clamp utförs i nervceller och andra epitelceller, den låga andelen hela-cells tätning utredningen av electromotility av isolerade OHCs.
Här beskriver vi ett förfarande för att undersöka OHCs morfologiskt och elektrofysiologiskt i akut dissocierade snäckan från postnatal råttor. Denna metod kan ändras för att studera molekylära mekanismer som reglerar inre hår cell utveckling och funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hos råttor yngre än dag 11, kunde ingen action potential som svar på sund stimulering observeras i hörselbarken6,7. Därför beskrivs postnatal dag 11 som ”hörsel debut”10. Utvecklingen av förhandlingen funktion innan förhandlingen debut inte var väl studerat ännu. Med liknande metod för vuxna ABR inspelning, visar vi att ABR kunde utlösas av ren ton burst från råttungar yngre än P11 (figur 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av anslag från programmet 973 (2014CB943002) och den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (11534013, 31500841).
Materials
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. a. n. t. o. s. -., J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -. S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. . Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
