स्तन कैंसर में HER2 जीन प्रवर्धन की विविधता का आकलन करने के लिए एक उच्च प्रवाह जांच मंच का निर्माण
Summary
HER2 के विषम वितरण-सकारात्मक कोशिकाओं स्तन कैंसर का एक सबसेट में देखा जा सकता है और नैदानिक दुविधाओं उत्पन्न करता है. यहां, हम एक विश्वसनीय और लागत प्रभावी प्रोटोकॉल को परिभाषित करने, यों, और विषम प्रसंस्कृत स्तन कैंसर की एक बड़ी श्रृंखला में HER2 अंतर ट्यूमर आनुवंशिक विविधता तुलना परिचय ।
Abstract
मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2) के खिलाफ लक्षित चिकित्सा मौलिक HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर के साथ रोगियों के परिणाम बदल दिया है । हालांकि, मामलों की एक अल्पसंख्यक HER2-सकारात्मक कोशिकाओं है, जो प्रमुख नैदानिक चुनौतियों उत्पंन की एक विषम वितरण प्रदर्शित करता है । तिथि करने के लिए, बड़े साथियों में HER2 विषम जीन प्रवर्धन के लक्षण वर्णन और ठहराव के लिए कोई विश्वसनीय और मानकीकृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव किया गया है । यहां, हम एक उच्च प्रवाह पद्धति के लिए एक साथ कई स्तन कैंसर के विभिंन स्थलाकृतिक क्षेत्रों में HER2 स्थिति का आकलन वर्तमान । विशेष रूप से, हम प्रयोगशाला प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए बढ़ाया ऊतक microarrays (TMAs) ट्यूमर का एक लक्षित मानचित्रण शामिल निर्माण । सभी TMA मानकों को विशेष रूप से formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) स्तन ऊतकों की सीटू संकरण (शिष्यवृत्तीची) में चांदी के लिए अनुकूलित किया गया है । शकुन और पूर्वानुमानित Immunohistochemical का विश्लेषण (यानी, ईआर, पीआर, Ki67, और HER2) स्वचालित प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाना चाहिए । एक स्वनिर्धारित शिष्यवृत्तीची प्रोटोकॉल कई ऊतकों कि विभिंन निर्धारण, प्रसंस्करण, और भंडारण प्रक्रियाओं के पार एक उच्च गुणवत्ता आणविक विश्लेषण की अनुमति देने के लिए लागू किया गया है । इस अध्ययन में, हम एक सबूत के सिद्धांत प्रदान करते है कि विशिष्ट डीएनए दृश्यों एक कुशल और लागत प्रभावी विधि का उपयोग कर कई और विषम प्रसंस्कृत स्तन कैंसर के अलग स्थलाकृतिक क्षेत्रों में एक साथ स्थानीयकृत किया जा सकता है ।
Introduction
HER2 एक आद्य-oncogene है कि और अधिक व्यक्त और सभी इनवेसिव स्तन कैंसर के 15-30% में प्रवर्धितहै1, 2 । HER2 एक्सप्रेस की उपस्थिति से आस्थगित है > 10 मजबूत झिल्ली immunohistochemical (आइएचसी) धुंधला (3 +) के साथ% कोशिकाओं, जबकि जीन प्रवर्धन का मूल्यांकन किया जा सकता है जब या तो HER2/centromere अनुपात ≥ 2 या जीन प्रति संख्या है ≥ 6, पर गिनती पर सीटू संकरण (ISH)3 में से कम से 20 कोशिकाओं ।
अंतर ट्यूमर आनुवंशिक विविधता व्यापक रूप से स्तन कैंसर में वर्णित किया गया है, के लिए एक संभावित प्रतिकूल योगदानकर्ता जा रहा है और परीक्षण उपचार प्रतिक्रिया4। कॉलेज ऑफ अमेरिकन पैथोलॉजिस्ट (कैप) के अनुसार, HER2 विविधता मौजूद है यदि HER2 में परिवर्धित है > 5% और ट्यूमर कोशिकाओं को घुसपैठ करने का < 50%5। अफसोस की बात है, स्तन कैंसर में HER2 स्थानिक विविधता की वास्तविक घटना पैथोलॉजिस्ट के बीच विवाद का विषय बनी हुई है, कुछ लेखकों को बनाए रखने के साथ कि यह एक बेहद दुर्लभ घटना है, और दूसरों के सुझाव है कि मामलों के ४०% तक कर रहे है HER2-विषम1,5,6,7,8,9,10. जैविक तंत्र है कि इस हालत underpin अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे है के बावजूद, शकुन और अंतर ट्यूमर HER2 विविधता के नैदानिक प्रभावों स्तन कैंसर रोगियों के लिए महत्वपूर्ण है11।
हाल ही में, उज्ज्वल क्षेत्र आणविक तकनीक, जैसे chromogenic ish (CISH) और चांदी ish (शिष्यवृत्तीची) के रूप में, विविधता ऊतकों में HER2 FFPE का पता लगाने के लिए विश्वसनीय तरीके के रूप में उभरा है, फ्लोरोसेंट ISH (मछली)12की तुलना में कुछ लाभ के साथ. अफसोस, एकल मामलों के थोक विश्लेषण बड़े पलटन अनुसंधान अध्ययन में अव्यावहारिक रहता है । कई समूहों ने सुझाव दिया है कि histochemistry, आइएचसी के संयोजन, और TMA प्रौद्योगिकियों के साथ ISH कैंसर जीव विज्ञान13,14,15,16के अध्ययन में एक मूल्यवान रणनीति का प्रतिनिधित्व कर सकता है । इस व्यापक रूप से अपनाया विधि के साथ, विभिन्न रोगियों से ऊतक के नमूने समवर्ती विश्लेषण किया जा सकता, ऊतक और रिएजेंट को कम करने और इस तरह के मामलों की एक बड़ी श्रृंखला के समान विश्लेषण को बढ़ावा देने के14. हालांकि, कोई प्रोटोकॉल के लिए एक साथ उच्च प्रवाह आणविक लक्षण वर्णन के लिए उपलब्ध है एकाधिक ऊतक नमूनों कि रिएजेंट, निर्धारण समय के संदर्भ में विभिंन प्रसंस्करण से गुजरा, और संरक्षण के तरीके कार्यरत हैं, ऐसे अभिलेखीय के रूप में ब्लॉक.
स्तन कैंसर में HER2 स्थानिक विविधता के शकुन और नैदानिक निहितार्थ को देखते हुए हमने विषम प्रसंस्कृत मामलों की बड़ी श्रृंखलाओं में इसका आकलन करने के लिए एक एकीकृत आणविक मंच विकसित किया. यहां, हम प्रयोगशाला रणनीतियों चित्रित करने के लिए उत्पंन और शिष्यवृत्तीची के माध्यम से स्तन कैंसर के उच्च उपज TMAs में HER2 प्रवर्धन के इंट्रा ट्यूमर विविधता का विश्लेषण । निंनलिखित प्रोटोकॉल को मापने ट्यूमर के लिए विकसित किया गया है > 5 मिमी (> टीएनएम २०१७ के अनुसार pT1b)17। छोटे घावों के लिए, हम पूर्ण चेहरा धारावाहिक वर्गों पर विश्लेषण करने की सलाह देते हैं । हमारी प्रक्रिया के लिए एक साथ आइएचसी और शिष्यवृत्तीची विश्लेषण के लिए अनुमति देता है अप करने के लिए 30 स्तन कैंसर, प्रत्येक मामले के लिए 6 अलग क्षेत्रों (रेंज 4-8) के एक मतलब को शामिल । कुल मिलाकर, १८० व्यास में 1 मिमी के ऊतक कोर, कोर के बीच ५०० µm के साथ, और ग्रिड और किनारों के बीच 2 मिमी प्रत्येक TMA ब्लॉक के लिए उत्पंन किया जाएगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम है प्रयोगशाला रणनीतियों विस्तृत करने के लिए HER2 जीन और इसके इसी centromere के शिष्यवृत्तीची विश्लेषण प्रदर्शन विषम प्रसंस्कृत स्तन कैंसर के उच्च उपज TMAs में । यह विधि लागत प्रभावी है और सबसे प्रयोगश…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई.
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
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