भौगोलिक शोष की एक बड़ी आंखों मॉडल में मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न-रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के रेटिना प्रत्यारोपण
Summary
रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं शुष्क उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन के उन्नत रूप के लिए एक सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा के रूप में सेवा कर सकता है. इस प्रोटोकॉल की पीढ़ी का वर्णन एक बड़ी भौगोलिक शोष की आंखों मॉडल और मानव भ्रूण स्टेम कोशिका के रेटिना प्रत्यारोपण रोग के इस मॉडल में रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं व्युत्पंन ।
Abstract
भौगोलिक शोष (GA), शुष्क आयु से संबंधित धब्बेदार अध-पतन की देर चरण रेटिना वर्णक उपकला (RPE) परत की हानि की विशेषता है, जो महत्वपूर्ण रेटिना संरचनाओं के बाद के अध-पतन की ओर जाता है (उदा., photoreceptors) जिससे गंभीर दृष्टि हानि । इसी प्रकार, RPE-हानि और कम दृश्य तीक्ष्णता में देखा जाता है लंबी अवधि के साथ रोगियों का पालन उन्नत गीला उम्र से संबंधित धब्बेदार अध (AMD) प्राप्त intravitreal विरोधी संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) उपचार. इसलिए, एक तरफ, यह कुशलतापूर्वक एक असीमित स्रोत है कि प्रतिस्थापन थेरेपी के रूप में सेवा कर सकता से RPE कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए मौलिक है । दूसरी ओर, यह व्यवहार और मानव में लागू उन लोगों के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में शल्य चिकित्सा और इमेजिंग तरीकों पर जोर देने रोग के एक मॉडल में व्युत्पन्न कोशिकाओं के एकीकरण का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहां, हम एक विस्तृत हमारे पिछले प्रकाशनों कि albino खरगोश आंख का उपयोग कर GA के एक पूर्व चिकित्सा मॉडल की पीढ़ी का वर्णन के आधार पर प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (hESC-RPE) के मूल्यांकन के लिए एक नैदानिक प्रासंगिक सेटिंग । विभेदित hESC-RPE नािो के साथ भोली आँखों या आँखों में प्रत्यारोपित कर रहे हैं3-प्रेरित GA-रेटिना अध-पतन की तरह एक 25 ग्राम transvitreal पार्स प्लाना तकनीक का उपयोग कर. multimodal और प्रत्यारोपित क्षेत्रों का मूल्यांकन उच्च संकल्प गैर इनवेसिव वास्तविक समय इमेजिंग द्वारा किया जाता है ।
Introduction
इस प्रोटोकॉल एक बड़ी भौगोलिक शोष (GA) कि प्रत्यारोपण hESC-रेटिना अंतरिक्ष में RPE के एकीकरण के मूल्यांकन की अनुमति देता है के नैदानिक मॉडल आंखों की पीढ़ी का वर्णन करता है । यहां विस्तार से वर्णित तरीके 3 हाल के प्रकाशनों में इस्तेमाल किया गया है कि एक समृद्ध, शुद्ध, और कार्यात्मक RPE कोशिकाओं के hESC से जनसंख्या के उत्पादन का प्रदर्शन1, साथ ही बाहरी रेटिना क्षति के निर्माण और एक GA-phenotype की तरह शारीरिक नमक समाधान (यानी, बीएसएस और पंजाबियों) या नािो3 खरगोश नेत्र2,3में से रेटिना इंजेक्शन द्वारा प्रेरित । हम आगे का प्रदर्शन किया है कि उप रेटिना निलंबन प्रत्यारोपण के hESC-RPE फार्म व्यापक कार्यात्मक monolayers के साथ photoreceptor बचाव क्षमता2.
कई फायदे रोग का एक GA मॉडल की पीढ़ी के लिए खरगोश आंख के उपयोग के साथ । सबसे पहले, खरगोश आंख के आकार, जो ७०% एक वयस्क मानव आंख की मात्रा है, नैदानिक सार्थक प्रत्यारोपण एक कोशिका घनत्व है कि नियमित रूप से बहुत कम है का उपयोग करने की अनुमति देता है छोटे चूहे की आंखों में इस्तेमाल किया (१,००० कोशिकाओं/µ l बनाम ५०,००० कोशिकाओं/µ l)4 , 5. दूसरे, कुतर में सर्जरी आमतौर पर रंजित के माध्यम से transscleral है, जो रेटिना बाधा समझौता और संभावित एक भड़काऊ प्रतिक्रिया और एक संभव अस्वीकृति6ट्रिगर । दोनों कारक एक साथ multilayering और प्रत्यारोपित कोशिकाओं के झुरमुट का नेतृत्व कर सकते हैं, और एक बाधित देशी रेटिना ऊतक में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के एक समग्र गरीब एकीकरण. हालांकि, बड़े खरगोश मॉडल आंखों एक नैदानिक सेटिंग के लिए समान इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ एक शल्य चिकित्सा तकनीक प्रदर्शन की अनुमति देता है । तीसरे, एक बड़े मॉडल आंखों भी vivo इमेजिंग और प्रत्यारोपित कोशिकाओं की निगरानी में उच्च संकल्प और समय1,2,3के माध्यम से भारी रेटिना की अनुमति देता है । इस प्रकार, हम एक नैदानिक प्रासंगिक और लागत कुशल नैदानिक मॉडल है कि एक सामांय और रोगग्रस्त रेटिना और उप रेटिना अंतरिक्ष के अनुसंधान में रुचि के साथ किसी के लिए कुतर के लिए एक आकर्षक विकल्प होना चाहिए का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, vivo में hESC-RPE एकीकरण का मूल्यांकन करने के लिए एक बड़ी आंखों के मॉडल GA और इसके नैदानिक उपयोग की पीढ़ी का वर्णन किया गया है ।
7क्लिनिक में GA और संबंधित रोगों के लिए अपक्ष?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन कारोलिंस्का संस्थान, क्राउन राजकुमारी Margareta के नेत्रहीनों के लिए फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, नेत्र अनुसंधान के लिए एडविन जॉर्डन फाउंडेशन, स्वीडिश नेत्र फाउंडेशन, राजा गुस्ताव वी फाउंडेशन, ARMEC Lindeberg फाउंडेशन, और Cronqvist फाउंडेशन ।
Materials
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30g 0.5’’; 0.3 x 13mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4 % trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25G/38G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25G/38G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 |
References
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