해 부와 Allantoic 첨부 파일의 생체 외에서 분석 Murine Allantois Explant 문화

Summary

생체 외에서 시험 모델 chorioallantoic 첨부 파일, 태 반 형성의 첫 번째 단계를 설명합니다. 프로토콜에 고정된 α4β1 integrin murine allantoides의 해 부 및 explant 문화를 보여 줍니다. 미리 정해진된 시간 포인트 allantois 첨부 현미경으로 평가 됩니다.

Abstract

태 반 포유류 배아의 개발과 성장을 위해 필수적 이다. 이러한 이유로 수많은 유전 변경 및 태 반 개발 또는 기능을 방해 하는 가능성이 또한 환경 모욕 쥐와 인간에서 이른 임신 손실을 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 태 반 형성에 미치는 잠재적 영향에 대 한 화면 분석 간단한 체 외에 부족 합니다. 여기, 우리는 allantois의 첨부는 chorion 이루어져 있는 태 반 형성에 중요 한 첫 번째 단계를 모델링에 초점. 빠르게 움직이지 α4β1 integrin chorio 모방 기판 역할에 allantoic explants의 첨부 파일을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 생체 외에서 이렇게 하면 첨부 파일 및 확산 다른 연속 시간 포인트에서 여러 allantois explants의 동작의 질적 평가 수 있습니다. 타겟된 마우스 돌연변이, 약물, 또는 임신 합병증 이나 allantois 첨부 ex vivo에태아 손실에 연결 된 다양 한 환경 요인의 효과 조사 하는 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

Introduction

태 미 발달 성장과 자 궁 환경에서 개발을 위한 불가결 하지 않습니다. 그것은 내 분 비 및 면역 기관으로 산소, 대사 산물, 및 태아 및 산 순환, 그리고 또한 기능 간의 영양 교환을 위한 인터페이스를 구성합니다. Placental 발달을 손상 하는 내 인 성 또는 외 인 모욕 자궁내 성장 지체, 태아 손실, 또는 임신 합병증, 생쥐와 인간¹에서 발생할 수 있습니다. 비정상적인 태 반 생리학 시키는 대상된 마우스 돌연변이의 수 증가², 219 genotypes 현재 마우스 게놈 정보 과학 (MGI) 웹사이트에 나열 된 계속 되는 동안 (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), 기계 론 적인 관점에서 잘 이해 되지 않습니다 많은이 고기. 이외에 유전 변경, 작은 분자 약물, 단일 클론 항 체, 독 소, 병원 체, 과잉 대사 또는 다양 한 환경 요원 영향을 미칠 수 태 반 개발 및 기능^{3,,45 , 6 , 7}. 아직, 간단한 체 외에서 태 반 개발에서 모델 중요 한 단계는 부족 한 분석 실험.

(탯의 발달 전조) allantois chorion⁸쪽으로 성장 하는 새싹으로 태아의 뒤 끝에서 나올 때 murine placental 개발 초기 midgestation에서 시작 됩니다. Allantoic 새싹의 외부 층에서 Chorioadhesive 셀 중재 첨부 파일 그리고 allantois chorion (chorioallantoic “퓨전”)의 표면에의 확산. chorion 이후에 villi는 미로, 영양분과 산소 juxtaposed 밀접 하 게 모성 혈액 사인 및 배아 용기^{9 사이 교환 되 안 태 반 층을 형성 하는 allantois의 맥 관 구조 성장에 주름 ,10}.

allantois의 첨부는 chorion 미로 형성에 중요 한 초기 단계 이며,이 과정에서 결함에 있는 미 발달 치 사 율의 가장 일반적인 원인 중 midgestation¹. 어디 chorioallantoic 첨부 파일¹⁰, 발생을 실패 하 고 MGI 데이터베이스 현재 나열을 비정상적인 chorioallantoic 퓨전 (http:// 특징으로하는 108 마우스 돌연변이 마우스 돌연변이의 숫자는 설명 www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), 세포 상호 작용은 혈관 세포 접착 분자-1 (VCAM-1, allantoic mesoderm 표현) α4β1 integrin (chorionic mesothelium는에 표현 extraembryonic mesoderm에서 파생 된) chorioallantoic 첨부 파일 및 퓨전^11,,1213불가결 것 같다. 약 배아 날 (E) 7.5 VCAM-1 allantoic 줄기의 원심 2/3 내 표현 된다 나타났습니다 Immunohistochemical 전체 산 야생-타입 배아의 얼룩¹³ (1-4 somite 단계), 그리고의 식을 여전히 높은 동안에 chorioallantoic 첨부 파일 및-퓨전^11,12. chorion에 allantoic 첨부 파일의 오류는 일반적으로 자 궁 싹의 조직학 분석에 의해 감지 됩니다. 그러나, allantois 크기 사이와 같은 발달 단계¹⁴의 새끼 내 에서도 순수 높은 변수 이며는 allantois만 연결할 수 있는 chorion 신체 접촉 수 있도록 충분 한 크기에 도달 하는 때. 이 자연적인 변화를 반영, chorioallantoic 첨부 파일 일어난다 언젠가 사이 ~ E 8.0과 9.0 E에서 utero에서, 그리고 조직학이이 과정의 통계적으로 신뢰할 수 있는 평가의 많은 수의 분석에 의존 이므로 적절 한 발달 단계에서 충분 한 표본을 conceptuses.

여기, 우리 allantoic 첨부 파일 utero ex allantois 크기에 덜 의존 하는 평가 하는 방법을 설명 합니다. 우리 임신 쥐의 uteri에서 마우스 배아와 그들의 allantoides의 해 부를 입증 ~ 8 일 coitum 게시 (dpc; dpc 0.5 지정 질 플러그 감지), 그리고 allantois의 후속 문화 explants 고정된 α4β1에 integrins입니다. 이 메서드는 첨부 파일 및 여러 allantois explants 병렬에서 및 다른 연속 시간 점에서 확산의 급속 한, 기능 평가 수 있습니다. 프로토콜을 사용할 수 있습니다 allantois 첨부 비보 전에 대상된 돌연변이, 약물, 또는 다양 한 환경 요인의 영향에 대 한 화면으로.

Protocol

마우스 사육 Regierung 인 운터 프랑 켄에 의해 승인 되었다 그리고 모든 분석 모든 독일과 유럽 연합 해당 법률 및 규정 관리 및 실험 동물의 사용에 따라 실시 했다. 1. 결정의 코팅 전 Utero Allantois Explant 문화에 대 한 α4β1 Integrin와 플레이트 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 200 µ g/mL에서 동결 건조 된 murine α4β1 integrin reconstitute 미리 데워 진된 (37 ° C) PBS에에서…

Representative Results

이 프로토콜 murine allantoides ex vivo, explant를 격리 하는 방법을 설명 하 고 chorioallantoic 융합 vivo에서 동안 α4β1 integrin allantois 첨부, 중요 한 프로세스의 질적 평가 자세히 설명. 그림 1A-H 에서 대표적인 결과 allantois 격리 임신 자 궁에서 시작의 연속 단계를 보여 줍니다. 자 궁 뿔, 지방 조직 등 선박 (…

Discussion

혈 청, fibronectin 같은 프로 접착제 기질 분자의 풍부한 소스는 존재 allantois explants는 다양 한 플라스틱, 유리, 또는 필터 표면^9,16에 쉽게 연결 됩니다. 따라서, 수행된 분석 결과의 목표는 구체적으로 유전자 조작의 효과 조사 하는 경우 allantois 첨부 파일에 다른 치료 움직일 α4β1, 그것은 비 특정 바인딩 사이트 (예를 들어, 소 혈 청을 차단 하는 중?…

Materials

C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.