Disseksjon og Explant kultur Murine Allantois for In Vitro analyse av Allantoic vedlegg

Summary

Vi beskriver i vitro analysen modell chorioallantoic vedlegget, det første trinnet i morkaken formasjonen. Protokoll viser murine allantoides på immobilisert α4β1 integrin disseksjon og explant kultur. Allantois vedlegg evalueres mikroskopisk på bestemt tidspunkt.

Abstract

Morkaken er viktig for vekst og utvikling av pattedyr embryo. Av denne grunn kan mange genetiske endringer og trolig også miljømessige fornærmelser som forstyrrer morkaken utvikling eller funksjon forårsake tidlig Graviditet i mus og mennesker. Likevel mangler enkel i vitro analyser til skjermen for potensielle virkninger på morkaken formasjon. Her fokusere vi på modellering det første og avgjørende skrittet i morkaken formasjon, som består av feste allantois å plasmocitara. Vi beskriver en metode for å raskt vurdere feste allantoic explants på immobilisert α4β1 Integra som fungerer som en chorio-mimetic substrat. Dette i vitro gir en kvalitativ vurdering av vedlegget og spre virkemåten for flere allantois explants på ulike påfølgende tidspunkt. Protokollen kan brukes å undersøke effekten av målrettet musen mutasjoner, narkotika eller forskjellige miljøfaktorer som har vært knyttet til graviditet komplikasjoner eller fosterets tap på allantois vedlegg ex vivo.

Introduction

Morkaken er uunnværlig for embryonale vekst og utvikling i livmor miljøet. Det utgjør grensesnittet for oksygen, metabolitten og næringsstoffer utveksling mellom fosterets og mors sirkulasjon og også funksjoner som en immunologiske og endokrine organ. Alle endogene eller eksogene krenke som svekker placental utvikling kan føre til intrauterine vekst retardasjon, fosterets tap eller graviditet komplikasjoner, både mus og mennesker¹. Mens antall målrettet musen mutasjoner som forårsaker unormale placental fysiologi fortsetter å øke², med 219 genotyper som er oppført på webområdet musen genomet informatikk (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), mange av disse fenotyper er ikke godt forstått fra en mekanistisk synspunkt. I tillegg til genetiske endringer, små molekyl narkotika, monoklonale antistoffer, toksiner, kan patogener, overflødig metabolitter eller ulike miljømessige agenter påvirke morkaken utvikling og funksjon^{3,4,5 , 6 , 7}. ennå, enkel i vitro søk at modellen avgjørende skritt i morkaken utvikling er knappe.

Murine placental utvikling startes i tidlig midgestation, når allantois (utviklingspsykologi forløperen til navlestrengen) kommer fra den bakre enden av embryoet som en knopp som vokser mot plasmocitara⁸. Chorioadhesive celler i det ytterste laget av allantoic bud megle vedlegget og spredning av allantois på overflaten av plasmocitara (chorioallantoic “fusion”). Plasmocitara kaster deretter inn villi som er blodkar av allantois vokser til labyrinten, det indre placental laget der næringsstoffer og oksygen utveksles mellom tett juxtaposed mors blod sinusoids og embryonale fartøy^{9 ,10}.

Feste allantois til plasmocitara er første og avgjørende skritt i labyrinten formasjon defekter i denne prosessen er blant de vanligste årsakene til embryonale dødelighet i midgestation¹. Selv om en rekke musen mutanter har blitt beskrevet der chorioallantoic vedlegg mislykkes oppstår¹⁰, og MGI databasen for tiden viser 108 musen mutanter som er preget av unormal chorioallantoic fusion (http:// www.Informatics.JAX.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), intercellulære samspillet mellom vascular celle vedheft molekyl-1 (VCAM-1, på den allantoic mesoderm) og α4β1 integrin (uttrykt på chorion mesothelium, som er avledet fra extraembryonic mesoderm) synes å være uunnværlig for chorioallantoic vedlegg og fusion^11,12,13. Immunohistochemical farging av hele-mount vill-type embryo har vist at VCAM-1 er uttrykt i den distale to tredjedeler av allantoic stilken på ca embryonale dag (E) 7.5¹³ (1-4 somite scenen), og at uttrykket er fortsatt høy under chorioallantoic vedlegg og -fusion^11,12. Feil på allantoic tilknytning til plasmocitara oppdages vanligvis av histologiske analyser av livmor knopper. Men allantois størrelser er fysiologisk svært variabel i mellom og innenfor søppel av den samme utviklingsstadiet¹⁴, og allantois kan bare legge til plasmocitara når den har nådd en tilstrekkelig størrelse å fysisk kontakt. Reflekterer denne naturlige variasjoner, chorioallantoic vedlegg finner sted en gang mellom ~ E 8.0 og E 9.0 i uteroog en statistisk pålitelig evaluering av denne prosessen av histology er derfor avhengig av analyse av et stort antall conceptuses å få nok eksemplarer på den aktuelle utviklingsstadiet.

Her beskriver vi en metode for å vurdere allantoic vedlegg ex utero som er mindre avhengig av allantois størrelse. Vi viser Disseksjon av mouse embryoer og deres allantoides fra uteri gravid mus ~ 8 dager legge coitum (dpc; dpc 0,5 angir deteksjon av en vaginal plugg), og den påfølgende kulturen i allantois explants på immobilisert α4β1 integrins. Denne metoden gjør det mulig for en rask, funksjonelle evaluering av vedlegget og spre virkemåten for flere allantois explants parallelt og påfølgende annen poeng. Protokollen kan brukes til skjermen for effekten av målrettet mutasjoner, narkotika eller ulike miljømessige faktorer på allantois vedlegg ex vivo.

Protocol

Musen avl ble godkjent av Regierung Unterfranken, og alle analyser ble utført i strengt samsvar med alle tyske og EUs gjeldende lover og forskrifter om omsorg og bruk av forsøksdyr. 1. coating av være ferdig innen plater med α4β1 Integrin for Ex Utero Allantois Explant Culture Rekonstituer lyofilisert murine α4β1 integrin på 200 µg/mL i sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS). Fortynne til en siste konsentrasjon av 10 µg/mL forvarmes 37 ° c PBS. Pipetter 20 µL/vel a…

Representative Results

Denne protokollen beskriver en metode for å isolere og explant murine allantoides ex vivoog detaljer kvalitativ vurdering av allantois vedlegg til α4β1 integrin, en kritisk prosess under i vivo chorioallantoic fusion. Representant resultatene som vises i figur 1A–H viser de påfølgende trinnene i allantois isolasjon fra gravid livmor. Mors vev som omgir livmor hornene, som fettvev og fartøy (<strong cl…

Discussion

I nærvær av serum, som er en rik kilde av Pro lim ekstracellulær matrix molekyler som fibronectin, vil allantois explants lett legge til ulike plast, glass eller filter overflater^9,16. Dermed, hvis målet med utført analysen er spesielt undersøke effekten av en genetisk modifisering eller noen andre behandling allantois vedlegg til immobilisert α4β1, er det viktig å blokkere ikke-spesifikk bindende områder (f.eksmed bovin serum albumin) etter be…

Materials

C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.