Mesure de l’Expression des gènes dans les couches d’Aleurone orge bombardé avec un débit plus élevé

Résumé

Un protocole amélioré est présenté pour la mesure de l’expression transitoire de constructions de journaliste dans les cellules d’aleurone orge après le bombardement par des particules. La combinaison d’automatisé grain de meulage avec essais enzymatiques plaque 96 puits offre un débit élevé pour la procédure.

Résumé

La couche d’aleurone de grains d’orge est un important système modèle pour l’expression génique réglé par hormone chez les plantes. Dans les cellules d’aleurone, gènes requis pour la germination ou du développement de la plantule sont activés par la gibbérelline (GA), tandis que les gènes associés à des réactions de stress sont activés par l’acide abscissique (ABA). Les mécanismes de signalisation de GA et ABA peuvent être interrogés en introduisant des constructions de gène de journaliste dans les cellules d’aleurone par bombardement par des particules, avec l’expression transitoire résultante mesurée à l’aide d’essais enzymatiques. Un protocole amélioré est rapporté que partiellement automatise et simplifie l’étape d’homogénéisation de grain et les dosages enzymatiques, ce qui permet un débit nettement plus que les méthodes existantes. Homogénéisation des échantillons de grain se faite avec un homogénéisateur tissus automatisés, et GUS (β-glucuronidase) essais sont effectués à l’aide d’un système de plaque à 96 puits. Les résultats représentatifs en utilisant le protocole suggèrent que l’activité phospholipase D jouerait un rôle important dans l’activation de l’expression de gène HVA1 par l’ABA, par le facteur de transcription TaABF1.

Introduction

La couche d’aleurone de l’orge est un système de modèle bien établi pour l’étude de l’expression génique réglé par hormone en plantes¹. En particulier, un certain nombre de gènes nécessaires à la germination ou du développement de la plantule est activé par la gibbérelline (GA), tandis que les gènes associés à des réactions de stress sont activés par l’acide abscissique (ABA). Le GA et ABA, voies de signalisation sont entrelacées, comme l’expression de certains gènes activés par le GA est inhibée par l’ABA et vice versa¹.

Une stratégie utile pour comprendre que le rôle des acteurs particuliers....

Protocole

1. préparation des effecteurs et gène rapporteur construit

1. Construire des constructions d’effecteur qui emploient un promoteur constitutif (p. ex. maïs ubiquitine, UBI) à l’expression de la voiture d’un cadre de lecture souhaité. Par exemple, construire un plasmide contenant UBI::TaABF1 à disque forte l’expression constitutive de TaABF1⁵.
2. Construire des constructions de journaliste qui incluent le promoteur dont l’activité consiste à mesurer, placé en amont d’un cadre de lecture ouvert comme GUS. Par exemple, construire un plasmide contenant HVA1::GUS permettant de mesurer l’expression de ....

Résultats

La technique décrite ici peut servir à introduire toute construction de test génétique dans des cellules d’aleurone de grains d’orge. Le niveau d’expression du gène de l’essai peut alors être idéalement mesuré (Figure 2). Le protocole de débit supérieur décrit ici grandement augmente l’efficacité de la graine de meulage et les étapes de test enzyme. Cette méthode a été utilisée pour évaluer la capacité de la transcription factor TaABF1⁵

Discussion

L’introduction du gène de l’effecteur construit par bombardement par des particules, suivie d’une expression transitoire de constructions de journaliste est une stratégie utile pour disséquer le rôle des acteurs particuliers dans la signalisation de GA/ABA et du gène réglementés hormone qui en résulte expression.
Cependant, les protocoles existants pour mener à bien de telles expériences dans l’orge aleurone cellules^2,3,4

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
GeneElute HP plasmide Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
Spectrophotomètre UV-vis	Nanodrop	ND-1000
Grains d’orge de l’Himalaya	/	/	Une variété d’orge à grains nus (stocker dans l’obscurité à 4° ; C)
	Sigma	S2378	Réactif pour solution d’absorption
chlorure de calcium (dihydraté)	Fisher	C79-500	Réactif pour
d’absorption Solution d’absorption	faite maison	/	20 mM de succinate de sodium, 20 mM de chlorure de calcium, pH 5,0. Stériliser à l’autoclave avant utilisation.
chloramphénicol	Sigma	C0378	Préparer une solution mère à 10 mg/mL dans de l’éthanol à 70 %.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Utilisé pour les plaques de vermiculite.
cercles en papier filtre (90 mm)	Whatman	1001 090	Utilisé pour la vermiculite et pour la préparation des grains avant le bombardement
Vermiculite Plaques	faites maison	/	Ajouter 50 mL de vermiculite dans une boîte de Pétri en verre. Placez un cercle de papier de 90 mm sur la vermiculite. Autoclave.
Pince (à pointe fine)	Fisher	13-812-42	Utilisée pour enlever le tégument des grains d’orge.
Pince (pointe ultra fine)	Fisher	12-000-122	Utilisée pour enlever le tégument des grains d’orge.
microporteurs d’or (1.6 &mu ; m)	BioRad	1652264
macrotransporteurs	BioRad	1652335
calcium (dihydraté)	Fisher	C79-500	Préparez une solution mère de 2,5 M et conservez 1 mL d’aliquotes à -20°C.
spermidine	Sigma	S0266 Préparer	une solution mère de 100 mM et stocker 500 &mu ; L aliquotes à -20° ; C (à utiliser dans les 2 mois).
disques de rupture (1550 psi)	Écrans	d’arrêt 1652331
Système de distribution de particules	BioRad	PDS-1000/He
de sodium monobasique monohydraté	Sigma	S9638	Réactif pour phosphate de sodium 1M pH 7,2
de sodium dibasique	Sigma	S9763	Réactif pour phosphate de sodium 1M pH 7,2
1M phosphate de sodium pH 7,2	fait maison	/	Combinez 6,9 g de phosphate de sodium monobasique monohydraté avec 7,1 g de phosphate de sodium dibasique. Ajouter de l’eau à 100 ml. Ajoutez du NaOH pour obtenir un pH de 7,2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissoudre dans l’eau jusqu’à 1 M. Conserver à -20° ; dans 1 mL d’aliquotes.
leupeptine	Sigma	L2884	Dissoudre dans l’eau à 10 mg/mL. Conserver à -20° ;
C.glycerol	Sigma	G5516	Préparez une solution à 50 % dans l’eau.
Tampon de broyage	fait maison	/	Combiner 10 mL de phosphate de sodium 1 M pH 7,2, 500 &mu ; L de 1 M DTT, 100 &mu ; L de 10 mg/mL de leupeptine et 40 mL de glycérol à 50 %. Ajouter de l’eau à 100 ml.
billes en acier inoxydable (5 mm)	Qiagen	69989
Tubes de 2,0 mL	Eppendorf	22363352	Ce modèle spécifique de tube est recommandé pour une utilisation avec l’homogénéisateur.
homogénéisateur de billes (TissueLyser)	Qiagen	85210
Tubes à essai en verre de 12 mm x 75 mm	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Préparez une solution mère de 25 mM et conservez 1 mL d’aliquotes à -20°C.
ATP	Sigma	A7699	Préparez une solution mère de 100 mM et stockez-en 250 &mu ; L aliquotes à -20° ;   ;C.
Tris base	Sigma	T1503	Réactif pour 1M Tris sulfate pH 7,7.
sulfurique	Sigma	258105	réactif pour 1M Tris sulfate pH 7,7.
1M Tris sulfate pH 7,7	fait maison	/	Dissoudre 12,1 g de base Tris dans 100 mL d’eau. Ajustez le pH à 7,7 avec de l’acide sulfurique.
chlorure	de magnésium Sigma	M9397	Dissoudre dans l’eau à 2 M.
Tampon de dosage de luciférase (LAB)	fait maison	/	Combiner 3 mL de 1 M de sulfate de Tris pH 7,7, 500 &mu ; L de chlorure de magnésium 2 M, 1 mL de DTT 1 M et 200 &mu ; L de 0,5 M EDTA. Ajouter de l’eau à 50  ; Ml.
Mélange de dosage de luciférase	fait maison	/	Combiner 15 mL de LAB, 800 &mu ; L de 25 mM de luciférine, 200 &mu ; L de 100 mM d’ATP et 4 mL d’eau. Cela fait suffisamment de mélange de dosage (20  ; mL) pour 100 dosages de luciférase.
luminomètre (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-&beta ;-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissoudre dans le DMSO à 100 mM.
azoture de sodium	Sigma	S8032	Préparez une solution mère à 2 % dans l’eau et conservez 1 mL d’aliquotes à -20°C.
Plaques de 96 puits (standard)	Tampon de dosage Fisher	12565501
GUS	fait maison	/	Combiner 2,5 mL de MUG, 5 mL de 1 M de phosphate de sodium pH 7,2, 400 &mu ; L de 0,5 M EDTA, 1 mL de 1 M DTT, 100 &mu ; L de 10 mg/ml de leupeptine, 20 mL de méthanol et 1 mL d’azoture de sodium à 2 %. Ajouter de l’eau à 100 ml.
Film d’étanchéité	TempPlate USA Scientific	2921-1000
96 plaques de puits (noir)	Costar	3916
carbonate	de sodium Sigma	S7795	Préparer une solution de 200 mM dans l’eau.
4-méthylumbellifère	Sigma	M1381	Préparez un 100 &mu ; M dans l’eau. Congeler 1 mL d’aliquotes à -20° ;   ;C.
lecteur de fluourescence de microplaques	Bio-Tek	FLX-800

Réactif pour solution d’absorption solution chlorure de BioRad 1652336 supports de macrotransporteurs BioRad 1652322 phosphate phosphate acide