Denne protokol beskriver en ny metode giver mulighed for kvantitative visualisering af komplekse dannelsen af SNARE proteiner, baseret på Förster resonans energioverførsel og fluorescens levetid imaging mikroskopi.
Opløselige N– ethylmaleimide følsomme fusion protein (NSF) vedhæftet fil protein receptor (SNARE) proteiner er nøglen til membran menneskehandel, som de katalyserer membran fusion i eukaryote celler. SNARE protein familie består af omkring 36 forskellige medlemmer. Specifikke intracellulære transportruter er katalyseret af bestemte sæt af 3 eller 4 SNARE proteiner, der dermed bidrager til specificitet og troskab af membran handel. Men at studere de præcis funktion af SNARE proteiner teknisk udfordrende, fordi snarer er meget rigelige og funktionelt overflødig, med de fleste snarer at have flere og overlappende funktioner. I denne protokol, er en ny metode for visualisering af SNARE kompleks dannelse i levende celler beskrevet. Denne metode er baseret på at udtrykke SNARE proteiner C-terminalt smeltet til fluorescerende proteiner og måle deres interaktion ved Förster resonans energi overføre (FRET) beskæftiger fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). Ved montering af fluorescens levetid histogrammer med en stand i tænderne model, tillader FRET-FLIM (semi-) kvantitative skøn over brøkdel af SNARE kompleks dannelse på forskellige vesikler. Denne protokol har været anvendt med succes til at visualisere SNARE kompleks dannelse på plasma membran og endosomal rum i pattedyr cellelinjer og primære immunceller, og let kan udvides til at studere SNARE funktioner på andre organeller i dyr, planter og svampe celler.
Membran handel er et centralt element i eukaryote celler, hvor membranen vesikler bud ud fra en donor organelle og derefter flytte til og smelter med en target organelle1,2. Med undtagelse af mitokondrier, er alle disse membran fusion trin katalyseret af medlemmer af SNARE protein familie1,2. SNARE protein familie består af omkring 36 medlemmer i pattedyrsceller og ca. 20 i gær2. SNARE proteiner indeholder en eller to ~ 52 rester-lang, indbygget ustruktureret regioner, kaldet SNARE-motiver. SNARE proteiner er ofte bundet til membraner af en C-terminale transmembrane helix1,2. Snarer kan kategoriseres baseret på de centrale rester de bidrager til den komplekse SNARE ind arginin (R) og glutamin (Q) snarer1,2. Membran fusion er drevet af samspillet mellem 3 eller 4 beslægtet snarer, der sammen bidrager 4 SNARE-motiver og er fordelt over både donor og acceptor membran1,2. En SNARE komplekset består af en R-FÆLDE motiv og tre Q-SNARE motiver (betegnes Qa, Qb og Qc). Kompleks dannelse starter på N-termini SNARE-motiver, danner en såkaldt trans-SNARE-kompleks, og provenuet mod C-termini, danner en stram α-spiralformet rullet coil bundt kaldet et cis-SNARE-kompleks. Komplekse dannelsen af endnu en enkelt SNARE komplekse trækker donor og acceptor membraner sammen og overvinder energi barrieren for membran fusion3.
Tildele forskellige SNARE komplekser til specifikke transportruter i cellerne ofte teknisk udfordrende. Selvom snarer klart bidrage til specificiteten af membran handel, de er promiskuøs, funktionelt overflødige, og deres funktioner overlapper1,2. På grund af dette medfører undertrykkelse af netbårne eksperimenter målrettet snarer, som genet knockout, RNA-interferens, indførelsen af blokering antistoffer eller med opløselige SNARE fragmenter som dominerende negativer, ofte ikke klart fænotyper som andre Snarer kompensere2,4. Derudover er det vanskeligt at skelne specifikke membran fusion trin fra opstrøms menneskehandel begivenheder, fordi snarer kan inddrages i flere transport ruter2. Lokalisering undersøgelser af snarer ved mikroskopi metoder, ved hjælp af immunolabeling eller genetiske fusion til fluorescerende reporter proteiner, lider problemerne der: (i) snarer lokalisere til flere organeller som de ofte mægle flere menneskehandel trin, og (ii) deres lokaliseringer ensbetydende ikke automatisk med de er funktionelt involveret i SNARE kompleks dannelse. Endelig SNARE komplekser kan identificeres ved hjælp af immunoprecipitation eksperimenter ved hjælp af en af snarer som agn og andre snarer som mål, men det tillader ikke tildelingen af disse komplekser til specifikke organeller eller smuglerruter. Således i øjeblikket, er der ingen alternative teknik til at visualisere SNARE komplekser med organellar opløsning. Immunfluorescens er ikke i stand til at bevise SNARE interaktioner men kan vise kun tilstedeværelsen eller fraværet af co lokalisering, mens immunoprecipitation kun kan vise SNARE interaktioner i hele celle befolkningen men ikke tildele organeller hvor disse interaktioner forekomme.
For at overvinde disse begrænsninger, var for nylig udviklet en roman metode giver mulighed for kvantitative visualisering af SNARE komplekser i levende celler med organellar opløsning af Verboogen et al. 5 denne metode er baseret på udtryk for par af snarer med spektralt skiftede fluorescerende proteiner smeltet C-terminalt til deres transmembrane skruelinjer. Efter afslutningen af membran fusion og dannelsen af et cis-SNARE komplekse, disse fluorophores på C-termini af de transmembrane helices er straks sammenstillet med hinanden. Fluorophores er så godt i Förster afstand (typisk < 5 nm), resulterende i FRET fra green-skiftet donor fluorophore til rød-forskudt acceptor fluorophore5,6. ÆRGRE resultater i quenching donor fluorophore og en øget udledning af acceptoren fluorophore, der kan måles fra forholdet mellem donor og acceptor emission (ratiometric FRET). Dog ratiometric FRET mellem to forskellige molekyler udfordrende, på grund af fluorescens cross-talk og forskellige niveauer af donor og acceptor snarer på forskellige organeller og blandt celler7,8. FRET kan også måles fra fluorescens levetid, som er tid mellem excitation og emission af en foton. Hvis donor fluorophore kan frigive sin energi af ÆRGRE, denne konkurrerende proces resulterer i en tilsyneladende afkortning af fluorescens levetid. Dette kan måles ved FLIM7,8. Levetid FRET er meget mere robust end ratiometric FRET for måling interaktioner mellem to forskellige molekyler, som fluorescens levetid er en iboende egenskab ved et fluorophore og er ufølsom over for dets koncentration. Derudover er FRET tilnærmelse kvantitative, fordi effektiviteten af FRET er omvendt proportional med den sjette effekt af afstanden mellem donor og acceptor fluorophores (hovedsagelig en step-funktion). Derfor, ved montering af fluorescens levetid histogrammer registreres af FLIM med en dobbelt-komponent henfald model, FRET-FLIM giver mulighed for den (semi-) kvantitative skøn over brøkdel af SNARE molekyler engageret i SNARE kompleks dannelse5.
For nylig, denne FRET-FLIM metode blev brugt af Verboogen et al. at visualisere SNARE kompleks dannelse i primære dendritiske celler i immunsystemet5. Det var vist, at ved støder en patogene stimulus, dendritiske celler omdirigere deres membran handel ledsaget af en øget kompleksbindende Rasmussen-SNARE vesikel-associerede membran protein (VAMP) 3 med Qa-SNARE syntaxin 4 specifikt på den plasma membran. Denne øgede SNARE kompleks dannelse er sandsynligvis skal opfylde den øgede sekretoriske kapacitet for udskillelsen af inflammatoriske cytokiner som interleukin-65. Denne protokol beskriver de eksperimenterende trin, der bruges til erhvervelse af FRET-FLIM data visualisering og (semi-) kvantitativ måling af SNARE komplekser.Det er forklaret, hvordan til at passe de hele-celle fluorescens levetid histogrammer med mono – og bi-eksponentiel henfald funktioner, resulterer i den tilsyneladende fluorescens levetid som et kvantitativt skøn til SNARE interaktioner. I denne protokol, den udbredte HeLa cellelinie bruges som eksempel, men metoden, der let kan udvides til også for at studere SNARE komplekser i andre eukaryote celler.
Denne protokol demonstrerer brugen af FRET-FLIM til visualisering af SNARE interaktioner mellem syntaxin 4 og VAMP3 i live HeLa celler. Syntaxin 4 er en Qa-SNARE protein overvejende at lokalisere på plasmamembran hvor det medierer exocytose1,2,20,21. VAMP3 er en R-FÆLDE, som beskrives primært for at finde på genbrug endosomal rum og formidler handel til andre endosomes samt om plasma membran1,2,20. FRET-FLIM assay kan dog let tilpasses til at studere andre SNARE proteiner. Den eneste betingelse er, at disse snarer indeholder et C-terminale transmembrane helix, hvilket er tilfældet for de fleste SNARE proteiner af langt1,2. Derudover kan protokollen beskrevet her tilpasses til visualisering af SNARE komplekser i alle eukaryote celletype, herunder planter og gær. I denne protokol brugte vi afkortning af fluorescens levetid af donor fluorophore som en foranstaltning af FRET. Som en supplerende tilgang, levetid af acceptoren fluorophore kunne undersøges, fordi den overfølsomme over emission forårsager en særskilt anledning fase som giver utvetydige beviser at resonans energioverførsel opstår.
I øjeblikket, kan FRET-FLIM teknik muligvis ikke visualisere SNARE komplekser i lysosomale rum. For syntaxin 3-mCitrine-mCherry tandem konstruktion, kan mCherry fluorescens ofte findes mere akkumulerede i et juxtanuclear område, hvilket sandsynligvis svarer til lysosomale rum, mCitrine signalet er mere rigelige i cellulære periferien5. En lignende juxtanuclear akkumulering af mCherry i forhold til mCitrine blev observeret, når de samme SNARE proteiner smeltet til disse fluorescerende proteiner var Co udtrykte5. Lysosomer er karakteriseret ved en meget lav pH (< 4) og en høj aktivitet af Proteolytiske enzymer. Juxtanuclear akkumulering af mCherry er sandsynligvis forårsaget af en højere modstand af mCherry fluorophore for lysosomale nedbrydning i forhold til mCitrine fluorophore. Det er ikke på grund af pH-quenching af mCitrine, da juxtanuclear akkumulering af mCherry også sker efter fiksering af celler5. Derved, FRET-FLIM teknik undervurderer mængden af FRET i regionerne juxtanuclear (lysosomale) og dette ville kræve andre fluorescerende reporter proteiner, at overlever de barske betingelser i lumen af lysosomer.
FRET-FLIM i princippet gør det muligt for at opnå en (semi-) kvantitative skøn over brøkdel af snarer i komplekse5. Som vi forklarede i denne protokol, kræver dette montering af fluorescens levetid histogrammer med dobbelt-eksponentiel henfald funktioner (ligning 2), hvor amplituden af komponenten hurtig er proportional med brøkdel af snarer i komplekse ( Ligning 3). Sådan montering med en to-komponent model er dog teknisk udfordrende. Montering med flere gratis fit parametre (to fluorescens levetider og to amplituder) kræver et meget stort antal fotoner, især da parametrene, der vil påvirke hinanden og små fejl i levetid vil amplituder og vice omvendt. For at overvinde disse montering problemer, fluorescens levetider af den langsomme komponent kan fastgøres til levetid af donor eneste betingelse (dvs.ingen FRET; kun mCitrine nuværende) og af komponenten hurtig til levetid af tandem bygge) maksimal expectable FRET). Men dette skal også tolkes med omhu, fordi fluorescens levetid ikke kan være den samme som i staterne kontrol, og kan afvige på grund af flere årsager (selvstændig quenching, dipol orientering, variationer i mikromiljø). Flere SNARE komplekser i umiddelbar nærhed (< 10 nm) kan resultere i afstand-afhængige FRET, samme princip, der tillader FRET skal bruges som en “Molekylær hersker”, men i dette tilfælde tilslører kvantificering af SNARE komplekser. Derudover er et kvantitativt skøn ikke altid meningsfuld, fordi mærket snarer konkurrere med endogene (umærkede) snarer. Som følge heraf er udtryk niveau af mCherry-mærket SNARE en vigtigste faktor for procentdelen FRET5. På grund af alle disse forbehold anbefales det at passe fluorescerende levetid histogrammer med en mono-eksponentiel henfald funktion (ligning 1). Dette har den fordel, at det ikke kræver nogen forudgående viden om levetid og den resulterende tilsyneladende gennemsnitlig fluorescerende levetid giver en solid foranstaltning for SNARE kompleksbindende5.
Ikke desto mindre forventes det, at kvantitative FRET-FLIM billeddannelse af to-komponent montering modeller vil have potent fremtidige ansøgninger. SNARE-kodning gener i kromosomet kan være smeltet med fluorescerende reporter proteiner, for eksempel af CRISPR/CAS9. Dette resulterer i fluorescerende mærkning af endogene SNARE proteiner, med endogene protein niveauer og ingen baggrund af umærket snarer, og giver mulighed dermed for en meningsfuld kvantitative skøn over brøkdel af SNARE komplekser af FRET-FLIM. Mens udtrykket niveauer af endogent snarer kan være ganske lav og give lav relativt fluorescerende signaler, det forventes, at et tilstrækkeligt antal fotoner kan indhentes, især for hele cellen FLIM (som kræver kun et par 1.000 s af fotoner). Desuden kan disse FRET-FLIM målingen foretages med mere følsomme lavine fotodiode detektorer, som medfører også højere fluorescens signaler og bedre photon statistik.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en Hypatia stipendium fra Radboud University Medical Center, en karriere udvikling Award fra Human Frontier Science Program, Gravitation programmet 2013 fra den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO; ICI-024.002.009), en VIDI tilskud fra NWO (ALW VIDI 864.14.001), og en begyndende tilskud fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs syvende rammeprogram (Grant aftale nummer 336479).
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
Hela cells | |||
35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
Fiji ImageJ | |||
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |