Denne protokollen beskriver en ny metode som tillater for den kvantitative visualiseringen av komplekse dannelsen av SNARE proteiner, basert på han selvmord resonans energioverføring og fluorescens levetid imaging mikroskopi.
Løselig N– ethylmaleimide følsom fusion protein (NSF) vedlegg protein reseptor (SNARE) proteiner er nøkkelen for membran menneskehandel, som de katalysere membran fusion i eukaryote celler. SNARE består protein av 36 ulike medlemmer. Bestemt intracellulære transportveier er katalysert av bestemte sett med 3 eller 4 SNARE proteiner som dermed bidrar til spesifisitet og gjengivelse av membran menneskehandel. Imidlertid er studere presis funksjon SNARE proteiner teknisk utfordrende, fordi snarer er svært rikt og funksjonelt overflødig, med de fleste snarer har flere og overlappende funksjoner. En ny metode for visualisering av SNARE komplekse formasjon i lever celler er beskrevet i denne protokollen. Denne metoden er basert på uttrykke SNARE proteiner C-terminalt smeltet fluorescerende proteiner og måle deres samspill av han selvmord resonans energi overføring (bånd) ansette fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM). Ved montering fluorescens levetid histogrammer med en multicomponent forfall, tillater bånd-FLIM (semi-) kvantitative estimering av brøkdelen av SNARE komplekse dannelsen på ulike blemmer. Denne protokollen har vært anvendt for å visualisere SNARE komplekse formasjonen i plasma membranen og endosomal rom i pattedyr linjer og primære immunceller, og kan lett utbygget for å studere SNARE funksjoner på andre organeller i dyr, plante og fungal cellene.
Membran menneskehandel er en sentral funksjon i eukaryote celler, der membran blemmer bud av fra en donor organelle flytte til og fusjonere med et mål organelle1,2. Bortsett fra mitokondriene, er alle disse membran fusion trinnene katalysert av medlemmer av SNARE protein familie1,2. SNARE består protein av 36 medlemmer i pattedyrceller og 20 i gjær2. SNARE proteiner inneholde ett eller to ~ 52 rester lang, innfødt ustrukturert områder, kalt SNARE-motiver. SNARE proteiner er ofte bundet til membraner ved C-terminalen transmembrane helix1,2. Snarer kan kategoriseres basert på sentrale rester bidrar til SNARE kompleks i arginine (R) og glutamin (Q) snarer1,2. Membran fusion er drevet av samspillet av 3 eller 4 beslektet snarer som sammen bidra 4 SNARE skipsverft og fordeles over både giver og acceptor membran1,2. En SNARE komplekset består av en R-SNARE motiv og tre Q-SNARE motiver (kalt Qa Qb og Qc). Komplekse formasjon starter på N-termini av SNARE-motiver, danner en såkalt trans-SNARE-kompleks, og fortsetter mot C-termini, danner en tett α-spiralformede coiled-coil bunt kalt cis-SNARE-kompleks. Komplekse dannelsen av selv en enkelt SNARE komplekse drar giver og acceptor membraner sammen og overvinner energien barrieren for membran fusion3.
Tilordne forskjellige SNARE komplekser til bestemte transportveier i celler er ofte teknisk utfordrende. Snarer tydelig bidra til spesifisiteten av membran handel, de er promiskuøse, funksjonelt redundant og deres funksjoner overlapper1,2. Derfor føre forstyrrelsene eksperimenter målretting snarer, som av genet knockout, RNA-interferens, innføring av blokkering antistoffer eller med løselig SNARE fragmenter som dominerende negativer, ofte ikke klar fenotyper som andre Snarer kompensere2,4. Dessuten er det vanskelig å skille bestemt membran fusion skritt fra oppstrøms menneskehandel hendelser, fordi snarer kan være involvert i flere transport ruter2. Lokalisering studier av snarer av mikroskopi tilnærminger, bruke immunolabeling eller genetisk fusion fluorescerende reporter proteiner, lider av problemer som: (i) snarer finne til flere organelles som de ofte megle flere menneskehandel trinn, og (ii) deres steder bety ikke automatisk de er funksjonelt engasjert i SNARE komplekse formasjonen. Til slutt, SNARE komplekser kan identifiseres ved hjelp immunoprecipitation eksperimenter med en av alle hans snarer som agn og de andre snarer som mål, men dette muliggjør ikke tildeling av disse kompleksene bestemt organeller eller smuglerrutene. Dermed foreløpig er det ingen alternativ teknikk å visualisere SNARE komplekser med organellar oppløsning. Immunofluorescence er ikke kunne bevise SNARE interaksjoner, men kan bare vise tilstedeværelse eller fravær av co lokalisering, mens immunoprecipitation bare kan vise SNARE interaksjoner i hele celle befolkningen, men ikke tilordne organeller der disse interaksjoner skje.
For å overvinne disse begrensning, ble en roman metode gir kvantitative visualisering av SNARE komplekser i levende celler med organellar oppløsning nylig utviklet av Verboogen et al. 5 denne metoden er basert på uttrykk for par snarer med spectrally skiftet fluorescerende proteiner smeltet C-terminal til deres transmembrane helikser. Etter ferdigstillelse av membran fusion og dannelsen av cis-FELLE komplekse, disse fluorophores på C-termini av transmembrane helikser er umiddelbart sidestilt med hverandre. Fluorophores er så godt innenfor han selvmord avstanden (vanligvis < 5 nm), resulterer i bånd fra green-forskjøvet donor fluorophore til rød-skiftet acceptor fluorophore5,6. SLITE resultater i slukke donor-fluorophore og en økte utslipp acceptor fluorophore som kan måles fra prosenter av giver og acceptor utslipp (ratiometric bånd). Men ratiometric bånd mellom to ulike molekyler er utfordrende, grunn av fluorescens cross-talk og ulike nivåer av giver og acceptor snarer på ulike organeller og blant celler7,8. BÅNDET kan også måles fra fluorescens levetid, som er tiden mellom magnetisering og utstråling av et foton. Hvis giveren fluorophore kan frigjøre sin energi av bånd, konkurrerende prosessen resultatet i en tilsynelatende forkortelse av fluorescens levetiden. Dette kan måles ved FLIM7,8. Levetid bånd er mye mer robust enn ratiometric bånd for å måle interaksjoner mellom to ulike molekyler, som fluorescens levetiden er en iboende egenskap av en fluorophore og er ufølsomme for sin konsentrasjon. Videre er bånd av tilnærming kvantitativ, fordi effektiviteten av bånd er omvendt proporsjonal med sjette makt avstanden mellom giver og acceptor fluorophores (i hovedsak en step-funksjonen). Derfor ved montering fluorescens levetid histogrammer spilt inn av FLIM med en dobbel-komponent forfall, tillater bånd-FLIM (semi-) kvantitative estimering av brøkdelen av SNARE molekyler i SNARE komplekse formasjon5.
Nylig, denne bånd-FLIM metoden ble brukt av Verboogen et al. visualisere SNARE komplekse formasjon i primære dendrittiske celler av immunsystemet5. Det ble vist at på møter en sykdomsfremkallende stimulans, dendrittiske celler omdirigere deres membran menneskehandel ledsaget av en økt complexing av R-SNARE vesicle-assosiert membran protein (VAMP) 3 med Qa-SNARE syntaxin 4 spesielt på den plasma membran. Denne økte SNARE komplekse formasjonen kreves sannsynlig å møte økt sekretoriske kapasiteten for utskillelsen av inflammatoriske cytokiner som interleukin-6-5. Denne protokollen beskriver eksperimentelle trinnene nødvendig for oppkjøpet av bånd-FLIM data visualisering og (semi-) kvantitativ måling av SNARE komplekser.Det forklares hvordan å passe hele celle fluorescens levetid histogrammer med mono – og bi-forfall eksponentialfunksjoner, noe som tydelig fluorescens levetiden som et kvantitativt overslag SNARE interaksjoner. I denne protokollen, mye brukt HeLa celle linjen brukes som et eksempel, men metoden kan lett utvides for å studere SNARE blant andre eukaryotic celler.
Denne protokollen demonstrerer bruken av bånd-FLIM for visualisering av SNARE interaksjoner mellom syntaxin 4 og VAMP3 i live HeLa celler. Syntaxin 4 er et Qa-SNARE protein hovedsakelig finne i plasma membranen der det formidler exocytosis1,2,20,21. VAMP3 er en R-SNARE som er hovedsakelig beskrevet Finn gjenvinning endosomal rom og formidler handel til andre endosomes også som plasma membranen1,2,20. BÅND-FLIM analysen kan imidlertid være lett tilpasses for å studere andre SNARE proteiner. Den eneste betingelsen er at disse snarer inneholde en C-terminalen transmembrane helix, som er tilfelle for de fleste SNARE proteiner av langt1,2. I tillegg kan protokollen beskrevet her tilpasses for visualisering av SNARE blant alle eukaryote celle type, inkludert planter og gjær. I denne protokollen brukte vi forkortelsen av fluorescens levetid donor fluorophore som et mål på bånd. Som en komplementær tilnærming, levetid acceptor fluorophore kan undersøkes, fordi sensitized utslipp forårsaker en distinkt stige fase som gir entydige bevis at resonans energioverføring skjer.
Foreløpig kan bånd-FLIM teknikken kanskje ikke visualisere SNARE blant lysosomale avdelinger. Syntaxin 3-mCitrine-mCherry tandem Konstruer finnes mCherry fluorescens ofte mer samlet i en juxtanuclear området, som trolig tilsvarer lysosomale avdelinger, mens mCitrine signalet er mer rikelig i mobilnettet periferien5. En lignende juxtanuclear opphopning av mCherry sammenlignet med mCitrine ble observert, når samme SNARE proteiner smeltet disse fluorescerende proteiner var co uttrykt5. Lysosomer er preget av en ekstremt lav pH (< 4) og en høy aktivitet av proteolytiske enzymer. Juxtanuclear akkumulering av mCherry er sannsynlig forårsaket av en høyere motstand av det mCherry fluorophore til lysosomale fornedrelse sammenlignet med mCitrine fluorophore. Det er ikke på grunn av pH-slukker av mCitrine, som juxtanuclear opphopning av mCherry oppstår også på fiksering av celler5. Dermed bånd-FLIM teknikken undervurderer hvor mye bånd i juxtanuclear (lysosomale) områder og dette vil kreve andre fluorescerende reporter proteiner som de harde forholdene i lumen lysosomer.
BÅND-FLIM i prinsippet kan få en (semi-) kvantitativt overslag av brøkdelen av snarer i komplekse5. Som vi forklart i denne protokollen, krever dette montering av fluorescens levetid histogrammer med dobbel-eksponensiell decay funksjoner (ligning 2), der amplituden til rask komponenten er proporsjonalt med brøkdel av snarer i komplekse ( Formel 3). Men er slike montering med en to-komponent teknisk utfordrende. Montering med flere gratis passer parametere (to fluorescens levetid og to amplituder) krever et stort antall fotoner, spesielt siden parameterne vil påvirke hverandre og små feil i livet vil påvirke amplitudes og vice omvendt. For å overvinne problemene montering, fluorescens levetid av langsom komponenten kan festes til levetiden til donor bare tilstand (dvs.ingen bånd, bare mCitrine tilstede) og for rask komponenten til levetiden til tandem konstruere) maksimal expectable bånd). Men bør dette også tolkes med forsiktighet, fordi fluorescens levetid ikke kan være det samme som disse kontroll stater, og kan avvike flere årsaker (selv slukke, dipol orientering, variasjoner i microenvironment). Flere SNARE komplekser i nærheten (< 10 nm) kan resultere i avstand-avhengige bånd, samme prinsipp som tillater bånd som en “molekylær hersker”, men i dette tilfellet tilslører kvantifisering av SNARE komplekser. Videre er et kvantitativt overslag ikke alltid mening, fordi de merket snarer konkurrere med endogene (umerkede) snarer. Som en konsekvens, er uttrykket mCherry-merket SNARE et programvareprodukt for ønsket bånd5. På grunn av alle disse ting anbefales det å passe fluorescerende levetid histogrammer med mono-eksponensiell decay funksjon (Formel 1). Dette har fordelen at det krever ikke en priori kunnskap om levetid og den resulterende tilsynelatende gjennomsnittlig fluorescerende levetiden gir et solid mål for SNARE complexing5.
Likevel er det forventet at kvantitative bånd-FLIM bildebehandling av to-komponent passende modeller har potente fremtidige anvendelser. SNARE-koding gener innenfor kromosomet kan være sammensluttet med fluorescerende reporter proteiner, for eksempel ved CRISPR/CAS9. Dette resulterer i fluorescerende merkingen av endogene SNARE proteiner, med endogene protein nivå og ingen bakgrunn av umerkede snarer, og gir dermed en meningsfull kvantitative estimering av brøkdelen av SNARE komplekser av bånd-FLIM. Mens uttrykket nivåer av endogen snarer kan være lav og gi lav relativt fluorescerende signaler, er det forventet at et tilstrekkelig antall fotoner kan oppnås, spesielt for hele cellen FLIM (som krever bare noen 1,000 s av fotoner). Videre kan disse bånd-FLIM målingene utføres med mer følsomme skred photodiode detektorer som vil også resultere i høyere fluorescens signaler og bedre Foton statistikk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Hypatia fellowship fra Radboud University Medical Center, en karriere Development Award fra menneskelige Frontier Science Program, gravitasjon program 2013 fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO; ICI-024.002.009), en VIDI grant fra NWO (ALW VIDI 864.14.001), og starte stipend fra europeiske Research Council (ERC) under EUs syvende rammeprogram (Grant avtale antallet 336479).
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
Hela cells | |||
35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
Fiji ImageJ | |||
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |