Denne protokol beskriver kombinatorisk brugen af ChIP-FF., 4sU-FF., total RNA-FF. og ribosomet profilering for cellelinjer og primærelementer. Det giver mulighed for sporing af ændringer i transkriptionsfaktor bindende, de novo transskription, RNA forarbejdning, omsætning og oversættelse over tid, og viser den samlede forløb i aktiveret og/eller hurtigt skiftende celler.
Ved aktivering, celler hurtigt ændre deres funktionelle programmer og dermed deres gen expression profil. Massive ændringer i genekspression forekomme, for eksempel under Celledifferentiering, morfogenese og funktionelle stimulation (f.eks. aktivering af immunceller), eller efter eksponering for stoffer og andre faktorer i det lokale miljø. Afhængigt af hvilken stimulus og celle sker disse ændringer hurtigt og på alle mulige niveauer af genregulering. Vise alle molekylære processer af en besvarende celle til en bestemt type af stimulus/narkotika er en af de sværeste opgaver i Molekylærbiologi. Her, beskriver vi en protokol, der giver mulighed for simultan analyse af flere lag af genregulering. Vi sammenligner især transskription faktor bindende (kromatin-immunoprecipitation-sekventering (ChIP-seq)), de novo transskription (4-thiouridine-sekventering (4sU-seq)), mRNA behandling, og omsætningen samt oversættelse (ribosomet profilering). Ved at kombinere disse metoder, er det muligt at vise en detaljeret og genome-wide handlingsforløb.
Sekventering nyligt transskriberede RNA anbefales især, når du analyserer hurtigt tilpasse eller ændre systemer, da det skildrer den transcriptional aktivitet af alle gener i løbet af 4sU eksponering (uanset om de er op- eller downregulated). Kombinatorisk brugen af total RNA-FF. og ribosomet profilering giver desuden beregningen af RNA omsætning og oversættelse priser. Bioinformatic analyse af høj overførselshastighed sekventering resultater giver mulighed for mange midler til analyse og fortolkning af data. Den genererede data giver også mulighed for sporing af co-transcriptional og alternativ splicing, bare for at nævne et par mulige udfald.
Den kombinerede metode beskrives her kan anvendes til forskellige modelorganismer eller celletyper, herunder primærelementer. Desuden, vi leverer detaljerede protokoller for hver metode, herunder kvalitetskontrol, og diskutere potentielle problemer og faldgruber.
I de seneste år blevet RNA-sekventering (RNA-seq) den norm værktøj til at analysere alle udtrykt RNA’er inden for en celle eller en organisme1. For at forstå hele processen med celler tilpasning som svar på en bestemt stimulus/stof, er det imidlertid nødvendigt at finde fuldt ud alle underliggende processer, spænder fra mRNA transskription til forarbejdning, omsætning og oversættelse. Kortsigtede ændringer i RNA transskription kan næppe måles ved total RNAseq, da ændringer af total RNA afhængige faktorer fx RNA halv-liv og transcriptional aktivitet, som er en dårlig skabelon for afspejler tilpasning af celler til miljømæssige virkninger2,3. Faktisk, en række nye sekventering teknikker blevet udviklet, der giver mulighed for en analyse af de forskellige skridt i gen forordning4 når de kombineres på den rigtige måde. Denne protokol beskriver hvordan man kan kombinere nogle temmelig let anvendelig sekventering teknikker, der giver mulighed for sporing regulering af de essentielle lag af mRNA i en sammenlignende måde. Til at analysere transcriptional aktivitet, en række forskellige metoder er blevet beskrevet, såsom Cap-analyse af genet udtryk (bur)5, native brudforlængelse udskrift sekventering (NET-seq)6og genome-wide nukleare køre (GRO-seq)7 , 8, og bromouridine-sekventering (Bru-seq) samt 4-thiouridine-sekventering (4sU-FF.), som bruger metabolitter, er indarbejdet i nyligt transskriberet RNA9,10, bare for at nævne nogle få. Mens bur identificerer eksakt transskription startsted, NET-FF. og GRO-seq levere mere præcise oplysninger om læsning retninger og 4sU-seq (som er metoden beskrevet her) registrerer kun nyligt transskriberet RNA. Dog 4sU-seq er yderst følsom og kan anvendes i forskellige tidsrammer til at måle kvantitativt transcriptional aktivitet i aktivt skiftende celler samt kvantitative ændringer i mRNA behandling (hvilket sker inden for minutter)9, 11,12. Desuden er 4sU-seq ideel til at kombinere med RNA-seq at beregne RNA omsætning satser for gener9. Transskription af mRNA er udført af RNA Polymerase II (RNAPII), som igen er påvirket af en lang række faktorer, såsom transkriptionsfaktorer, Histon ændringer og generelle aktivatorer/repressors, der kan endda være en del af det transkriptionel komplekse. For at teste hvor mange promotor-gen-forstærker regioner er bundet af en faktor, er ChIP-seq blevet udviklet, som er nu standard metode til dette formål, på grund af mange kommercielt tilgængelige antistoffer13. Men selv om ChIPseq giver klare oplysninger om hvor regulering faktorer binde, det afspejler ikke hvis det faktisk fører til ændringer i transskription14. Derfor er udfører ChIP-seq med 4sU-seq den ideelle kombination for sådanne biologiske spørgsmål. Regulering af genekspression kan også forekomme på et senere tidspunkt, da mRNA og protein niveauer ikke nødvendigvis korrelerer15,16, der angiver potentielt betydningsfulde forordning på translationel eller posttranslationelle niveau, afhængigt af sammenhængen. I år 2011, ribosomet profilering havde været først kombineret med RNA-FF. og er nu den foretrukne at kvantificere ændringer, der sker hurtigt i protein, da der er stadig nogle følsomhed grænser med massespektrometri17metode. Faktisk, oversættelse satser opnås fra sådanne metoder har vist sig at levere en relativt god skøn over ændringer i protein niveauer (i hvert fald målt for langsigtede ændringer) og giver mulighed for en endnu mere detaljeret visning på oversættelsesprocessen, fx den bestemmelse af start-side og alternativ oversættelse rammer17. Kombinatorisk brugen af alle fire metoder kan bruges i steady state, mellem forskellige celletyper, eller i en tid-serie eksperiment i en hurtigt skiftende celle11. Denne brug giver en genome-wide oversigt over ændringer i transskription faktor bindende påvirke RNA transskription, forarbejdning og oversættelse.
Analysere hele processen med genregulering er nødvendige for fuldt ud at forstå cellulære tilpasninger som reaktion på et specifikt stimulus eller behandling. Kombinere total RNA-FF., fører 4sU-FF., ribosomet profilering og ChIP-seq på forskellige tidspunkter til en omfattende analyse af de vigtigste processer af genregulering over tid. En dyb forståelse af biologiske processer er forpligtet til at definere den eksperimentelle opsætning samt optimale tidspunkter.
Da metoder til at studere genregulering forbedre hurtigt, kan disse protokoller tilpasses til hurtige ændringer. Ikke desto mindre, de giver de vigtigste metoder til at studere grundlæggende gen reguleringsmekanismer i nogen form for celle. Her diskuterer vi nogle af de faldgruber og fakta må man overveje, når du bruger disse metoder.
Celler: Cellerne skal være stærkt levedygtige, og hvis du bruger primær isolerede celler, renheden af cellepopulationer skal sikres (fxFACS analyse for primære T-celler). Selv lidt stressede celler kan påvirke resultaterne af disse meget følsomme sekventering metoder og sænke mængden af nyligt transskriberede eller oversat RNA og føre til uønskede udlæsninger af stressrespons i sekventering resultater. Centrifugering hastighed nævnt i denne protokol at sammenpresse cellerne er optimeret til primære T celler. Således, justere hastigheden efter celletype.
4 sU effekter på celle fysiologi: Ud over de førnævnte muligheder for kontrol minimal undertrykkelse af netbårne til cellulær fysiologi ved 4sU tilsætning, kan yderligere og/eller yderligere analyse udføres, især når celle numre er begrænset. Effekter på celle spredning kan testes ved at kontrollere den fordobling tid af celler ved blot at tælle mærket og umærket celler. Nucleolar stress induktion kan også blive testet ved at analysere celle morfologi via immunofluorescens farvning af nucleolin og kerner. For at yderligere kontrollere virkningen af 4sU, kunne ændrede globale genekspression måles ved at sammenholde læse tæller fra mærket total RNA til umærkede total RNA.
Celle numre: For in vitro- genereret T celler anbefaler vi at starte med mindst mængden af celler, der er angivet i tabel 2. Vælg passende tal pr. metode i henhold til typen celler. Da T-celler har mindre cytoplasma og RNA i forhold til andre celler, vil sandsynligvis lavere mængder af andre celler være tilstrækkeligt. For ChIP-FF. afhænger celle tal meget af antistof bruges og udtryk niveau af protein af interesse i cellerne. Histon eller RNAPII ChIP, kan færre celler bruges, celle tal skal øges når transkriptionsfaktorer bruges, især hvis de kommer til udtryk på et lavt niveau.
4 sU-mærkning og RNA biotinylation: Når du bruger vedhængende celler, kan 4sU mærkning rettes som beskrevet af Rädle al.. 19 da celler meget hurtigt at indarbejde 4sU, det kan føjes direkte til medium affjedring, tilhænger eller semi-vedhængende celler.
Det anbefales at starte i biotinylation med 60-80 µg af RNA. Ikke desto mindre, lavere mængder af RNA kan bruges, selv om vi ikke teste for mindre end 30 µg. Tilføj en coprecipitant (f.eks.GlycoBlue) Hvornår fældningen RNA hvis pellet er svært at se. Duffy et al. har også vist, at methylthiosulfonate-aktiveret biotin (MTS-biotin) mere effektivt reagerer med 4sU-mærket RNA end HPDP-biotin31. Derfor kan det være værd overvejer at skifte til MTS-biotin, navnlig for inddrivelse af små RNA’er, som har en tendens til at have færre uridine restprodukter (der henvises til den biotinylation protokollen som nævnt ved Duffy fl.; Se rensning af 4sU-mærket RNA, Eksperimentelle procedurer).
Inddrivelse af nyligt transskriberede RNA er det muligt at bruge Paramagnetiske perler eller RNA oprydning perler af dit valg. Altid tage i betragtning, at disse kits kan eller kan ikke rense for specifikke RNA’er. For eksempel, hvis du er interesseret i miRNAs, overveje at bruge specifikke kits til miRNA opsamling og sekventering.
Kvantificering af nyligt transskriberede RNA: For at nøjagtigt kvantificere nyligt transskriberede RNA, måling skal udføres af et egnet fluorometer (Se Tabel af materialer). Inden for 1 h af 4sU eksponering repræsenterer nyligt transskriberede RNA ca. 1-4% af total RNA. Nyligt transskriberede RNA 1 h mærket, aktiverede T celler består af ~ 90-94% af rRNA11.
Ribosomet profilering: Ved fastlæggelsen af metoden, vi har besluttet at bruge 1,5 x mængden af nukleasen end foreslog i den oprindelige protokol garanterer ordentlig fordøjelse. Også, ingen bivirkninger er blevet rapporteret til forhøjede mængder af nukleasen. Da det er ganske vanskeligt at overdigest RPFs, mens de er en del af RNA bundet af ribosomale proteiner, kan du stadig lidt forhøje beløbet for at titrere optimal nukleasen fordøjelsen.
Hvis mindre end 500 ng af RPF RNA blev inddrevet i trin 4.4.2, Gentag rRNA udtynding og pool renset RPFs med RNA Clean & koncentrator-5 kolonner. Alternativt kan du indlæse to identiske prøver ved siden af hinanden på gel (trin 4.5.3) og pool gel skiver under RNA eluering fra gel (trin 4.5.6).
Vi anbefaler, at skære i RPFs på en gel så stramt som muligt til de 28 og 30 nt bands. Dette hjælper med at fjerne uønskede fragmenter fra rRNAs og tRNAer, som senere vil blive en del af dit bibliotek og reducere sekventering læser for din RPFs.
Det anbefales også at undgå UV-lys under gel rensningen. Dette kan skabe rifter i RNA fragmenter, samt pyrimidin dimerer, der i sidste ende kan alvorligt påvirke bibliotek forberedelse og sekventering resultater.
Bibliotek forberedelse og sekventering af data: Ribosomet profilering protokollen gør det muligt for at generere en cDNA bibliotek egnet til sekvensering. Prøver genereret ved 4sU-mærkning kan bruges direkte til biblioteket forberedelse med enhver passende RNA sekventering kit. Siden nyligt transskriberede RNA, især når du bruger kort mærkning gange, måske endnu ikke polyadenylated, skal ingen poly-et udvalg udføres. I stedet anbefaler vi kraftigt rRNA udtynding at forhindre at reducere sekventering dybde for selve prøven. Ved hjælp af T-celler, vi startede med 400 ng af nyligt transskriberede og total RNA (afhængigt af kit, se materialer), udføres rRNA udtynding og reduceret cykler til PCR-amplifikation at minimere PCR bias. Biblioteket forberedelse kan udføres med mindre råvare. For at tage hensyn til biblioteket kompleksitet numre af PCR cykler skal optimeres.
For ChIP-seq findes der også mange kits til biblioteket forberedelse. I vores hænder bibliotek forberedelse arbejdede nå startende med 2 ng af ChIP DNA (Se materialer til et forslag om hvilke kit til brug). Sørg for at kontrollere indeks for color balance under sekvensering. Vi anbefaler en sekventering dybde af ≥40 x 106 læser hver for 4sU-FF., total RNA-FF., og ChIP-seq prøver og ≥80 x 106 læser til ribosomet profilering prøver. Sekventering dybden afhænger af prøven og downstream Bioinformatik analyse og bør overvejes nøje. For at analysere intronic læser til cotranscriptional splicing, 100 skal bp parret ende sekventering vælges.
Sekventering bias: Sekvensering er blevet guld standard ved fastsættelsen af de globale forandringer i transskription, translation eller transskription faktor bindende. Inden for de seneste år, eksisterende metoder blev skubbet til grænserne eller nye teknikker blev udviklet til sekvensering stadig mindre startbeløb af RNA. Dette kræver forstærkning af cDNA, der introducerer støj eller bias. For nylig, var unikke molekylære identifikatorer ((UMIS) velkommen) udviklet eksperimentelt identificere dubletter indført ved PCR. For nylig, blev det vist at (UMIS) velkommen bare mildt forbedre sekventering magt og falsk opdagelse sats for differential gen expression32. Ikke desto mindre, overveje at bruge unikke molekylære identifikatorer ((UMIS) velkommen) for alle sekventering biblioteker til kontrol for bibliotek kompleksitet, især når du starter med små mængder af RNA, og når mange PCR cyklusser er nødvendige.
Buffer og stamopløsninger: Alle buffere for 4sU-FF. og ribosomet profilering skal udarbejdes under streng RNase-fri betingelser ved hjælp af nukleasen-gratis vand. Det anbefales at købe pre-made nukleasen-fri NaCl, Tris-HCl, EDTA, natriumcitrat og vand. For at sikre nukleasen-fri betingelser, kan en RNase dekontaminering løsning bruges til at rense pipetter eller overflader. Alle buffere for ChIP-seq skal være mindst DNase-frit og kan opbevares ved stuetemperatur. Altid tilføje proteasehæmmere og eventuelt fosfatase hæmmere lige før brug og holde på is.
Bioinformatik: Analyse af alle sequencing data (dvs., ChIP-FF., RNA-FF. og ribsosome profilering) indebærer kvalitetskontrol (f.eks.ved hjælp af FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), adapter trimning (f.eks.med cutadapt20) efterfulgt af tilknytning til reference genom for celler under undersøgelsen. For RNA-seq data (både samlet og 4sU-FF.), såvel som ribosomet profilering data, er en splejset RNA-seq mapper påkrævet, såsom ContextMap 221. For ChIP-seq data unspliced tilpasninger er det tilstrækkeligt at bruge BWA-MEM22 . Genekspression kan beregnes ved hjælp af RPKM model (læser per Kilobase af Exon pr. Million fragmenter kortlagt)1, efter bestemmelse af læse tæller pr. gen ved hjælp af et program, f.eks. featureCounts23. For peak kald fra ChIP-seq data, en række programmer er tilgængelige, f.eks., MACS24 eller perle25. Yderligere kan downstream analyser udføres i R26, navnlig ved hjælp af værktøjer, som Bioconductor projekt27.
Her er en stor udfordring for integration af 4sU- og total RNA niveauer og translationel aktivitet fra ribosomet profilering normalisering. En klassisk tilgang til at løse dette problem er at normalisere til niveauer af hus-holder gener. For at reducere støj på grund af tilfældige udsving for individuelle hus-holder gener, anbefales det at ikke bare bruge et par hus-holder gener men median niveauer for et større sæt, fx den > 3.000 hus-holder gener udarbejdet af Eisenberg og Levanon28 . For beregning af RNA omsætning satser fra nøgletal af 4sU-til total RNA, normalisering er baseret på median omsætning satser (f.eks.under forudsætning af en RNA halveringstid på 5 h)29. Men da dette forudsætter ingen overordnede ændringer for hus-holder gener, vi anbefaler at bruge analyse tilgange uafhængigt af normalisering, fxkorrelation-baserede klynger af en tidsserie af forskellige datatyper til at identificere grupper af gener med forskellige adfærd i transskription og translation under aktiveringen. For en detaljeret beskrivelse af bioinformatical integrering af de forskellige datatyper henviser vi til den oprindelige publikation11.
Analyse af omsætning satser og data integration: En nyligt offentliggjort papir33 sammenligne halveringstider bestemmes af en multiplex gen kontrol (MGC) til globale metoder kunne vise at halveringstider korreleret bedst med dem, der opnås ved hjælp af metaboliske mærkning metoder i forhold til andre metoder (f.eks., generelle hæmning af transkription af narkotika). Men det bør nævnes, at forskellene mellem half-life beregninger kan opstå og har været beskrevet 15,34. Vi tegner sig for de fleste af de problemer og forskelle, der er indført ved stressrespons på grund af langvarig 4sU eksponering. Derfor er det nødvendigt at udelukke stressrespons indført ved 4sU-mærkning. Du kan yderligere validere omsætning satser, anbefaler vi brug af MGCs.
Derudover kunne et datasæt som genereret her også bruges til en mere Integrativ data analyse (f.eks., regulering af længe ikke-kodende RNA’er)35,36.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Lars Dölken for rådgivning til at etablere 4sU mærkning for primære T celler; Elisabeth Graf og Thomas Schwarzmayr for kritiske hjælp i biblioteket generationer og sekventering; Dirk Eick og Andrew Flatley for at give RNAPII og T-celle antistoffer; N. Henriette Uhlenhaut og Franziska Greulich for hjælp bibliotek forberedelse til ChIP-seq; Caroline C. Friedel blev støttet af tilskud FR2938/7-1 og CRC 1123 (Z2) fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher blev støttet af tilskud GL 870/1-1 fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) og den tyske Center for Diabetes forskning (DZD), Helmholtz Zentrum München.
4sU-labeling | |||
4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
Cell viability and stress assay | |||
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
p53 | abcam | ab26 | Optional |
p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
Buffers | |||
4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
Adaptors for 15 ml tubes | |||
Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
Ribosome Profiling | |||
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
(High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
ChIP | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
Agarose | gereral lab supplier | ||
Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
or antibody of interest | |||
Buffers | |||
Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
Nanodrop | Thermo Scientific | ||
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
or tubes special for your sonication device | |||
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 – 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
Magnetic stand for tubes | |||
Thermomixer | |||
Agarose gel electrophoresis | |||
Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |