Denne protokollen beskriver kombinasjon bruken av ChIP-seq, 4sU-seq, totalt RNA-seq og ribosom profilering for linjer og primære celler. Det kan spore endringer i transkripsjon-faktoren bindende, de novo transkripsjon, RNA behandling, omsetning og oversettelse over tid og vise samlede hendelsesforløpet i aktivert og/eller raskt skiftende celler.
Ved aktivering, cellene raskt endre sine funksjonelle programmer og dermed, gene expression profilen. Store endringer i genuttrykk oppstår, for eksempel under differensiering, morphogenesis og funksjonelle stimulering (for eksempel aktivering av immunceller), eller etter eksponering for narkotika og andre faktorer fra det lokale miljøet. Avhengig av hvilken stimulans og celle skjer disse endringene raskt og på alle mulige genet regulering. Viser alle molekylære prosesser i cellen svarer til en bestemt type stimulans/narkotika er en av de vanskeligste oppgavene i molekylærbiologi. Her beskriver vi en protokoll som samtidig analyse av flere lag av genet. Vi sammenligner, spesielt transkripsjon faktor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sekvenser (ChIP-seq)), de novo transkripsjon (4-thiouridine-sekvenser (4sU-seq)), mRNA behandling, og omsetning samt oversettelse (ribosom profilering). Ved å kombinere disse metodene, er det mulig å vise en detaljert og genom hele løpet av handlingen.
Sekvensering nylig transkribere RNA anbefales spesielt når analyserer raskt tilpasse eller endre systemer, siden dette viser transcriptional aktiviteten til alle gener i løpet av 4sU eksponering (uavhengig av om de er opp- eller downregulated). Kombinasjon bruk av totale RNA-seq og ribosom profilering gir i tillegg beregningen av RNA omsetning og oversettelse priser. Bioinformatic analyse av høy gjennomstrømming sekvensering resultater gir mange midler for analyse og tolkning av dataene. Genererte data kan også spore co-transcriptional og alternativ skjøting, bare for å nevne noen mulige utfall.
Kombinert tilnærming beskrevet her kan brukes for ulike modell organismer eller celletyper, inkludert primær celler. Videre vi tilbyr detaljert protokoller for hver metode brukes, inkludert kvalitetskontroll, og diskutere potensielle problemer og fallgruver.
De siste årene, har RNA-sekvenser (RNA-seq) blitt det standard verktøyet for å analysere alle uttrykt RNAs i en celle eller en organisme1. For å forstå hele prosessen med celler tilpasse svar på en bestemt stimulans/narkotika, er det imidlertid nødvendig å fullt ut bestemme alle underliggende prosesser, alt fra mRNA transkripsjon til behandling, omsetning og oversettelse. Kortvarige endringer i RNA transkripsjon kan neppe måles ved totalt RNAseq, siden endringer av totalt avhengig av faktorer f.eks RNA halv-liv og transcriptional aktivitet, som er en dårlig mal for reflekterer tilpasningen av celler miljømessige effekter2,3. Faktisk en rekke nye sekvensering teknikker er utviklet at en analyse av de ulike trinnene i prosessen genet regulering4 sammen på riktig måte. Denne protokollen beskriver hvordan kombinere noen ganske enkelt gjeldende sekvensering teknikker som tillater sporing regulering av viktige lag av mRNA i en komparativ måte. For å analysere transcriptional aktivitet, en rekke metoder har blitt beskrevet, som Cap-analyse av gene expression (bur)5, innfødt forlengelse transkripsjon sekvensering (NET-seq)6og genom hele kjernefysiske løpe (GRO-seq)7 , 8, samt bromouridine-sekvenser (Bru-seq) og 4-thiouridine-sekvenser (4sU-seq), som bruker metabolitter som er innlemmet i nylig transkribert RNA9,10, bare for å nevne noen. Mens bur identifiserer startwebstedet eksakt transkripsjon, NET-seq og GRO-seq levere informasjon om lesing retninger og 4sU-seq (som er metoden som er beskrevet her) oppdager bare nylig transkribert RNA. Men 4sU-seq er svært sensitive, og kan brukes i ulike tidsrammer måle kvantitative transcriptional aktivitet i aktivt å endre celler, samt kvantitative endringer i mRNA behandling (som skjer innen minutter)9, 11,12. Videre er 4sU-seq ideelt for å kombinere med RNA-seq beregne RNA Omsetningshastigheten for gener9. Transkripsjon av mRNA utføres av RNA Polymerase II (RNAPII), som igjen blir påvirket av en rekke faktorer, som transkripsjonsfaktorer, histone modifikasjoner og generell aktivatorer/repressors som kan også være en del av den transcriptional komplekse. For å teste hvor mange genet/Promotor/enhancer regioner er bundet av en faktor, er ChIP-seq utviklet, som er nå standard metode for dette formålet på grunn av mange kommersielt tilgjengelig antistoffer13. Men selv om ChIPseq gir klar informasjon på hvor regulere faktorer bind, reflekterer den ikke hvis det faktisk fører til endringer i transkripsjon14. Utføre ChIP-seq med 4sU-seq er derfor en ideell kombinasjon for slike biologiske spørsmål. Regulering av genuttrykk kan også oppstå på et senere tidspunkt, siden mRNA og protein ikke nødvendigvis samsvarer15,16, indikerer potensielt betydelige regulering på translasjonsforskning eller post-translasjonell nivå, avhengig av konteksten. Året 2011 ribosom profilering hadde vært først sammen med RNA-seq og er nå metoden for valg å kvantifisere endringene som skjer raskt i protein, siden det er fortsatt noen følsomhet grenser med massespektrometri17. Faktisk oversettelse priser fra slike metoder har blitt vist å levere et relativt godt anslag av endringer i protein nivå (minst målt for langsiktige endringer) og tillate en enda mer detaljert visning på prosessen med oversettelse, f.eks den fastsettelse av starten side og alternativ oversettelse rammer17. Kombinasjon bruk av alle fire metoder kan brukes i steady state, mellom ulike celletyper, eller i en tid-føljetong eksperimentere en raskt skiftende celle11. Dette gir en genomet-bred oversikt over endringer i transkripsjon faktor binding påvirke RNA transkripsjon, behandling og oversettelse.
Analysere hele prosessen med gene regulering er nødvendig å forstå mobilnettet tilpasninger som svar på en bestemt stimulans eller behandling. Kombinere totale RNA-seq, fører 4sU-seq ribosom profilering og ChIP-seq på ulike tidspunkt til en omfattende analyse av de viktigste prosessene av genet over tid. En dyp forståelse av biologiske prosesser er nødvendig å definere den eksperimentelle oppsett samt optimale tidspunkt.
Siden metoder å studere genet regulering forbedre raskt, kan disse protokollene tilpasses til raske endringer. Likevel gir de viktigste metoder for å studere grunnleggende genet regulatoriske mekanismer i enhver type celle. Her diskuterer vi noen av fallgruvene og fakta man må vurdere når du bruker disse metodene.
Celler: Cellene må være svært levedyktig, og hvis bruker primære isolert celler, renheten av celle populasjoner må garanteres (f.eksFACS analyse for primær T-celler). Enda litt stresset celler kan påvirke resultatene av disse svært sensitive sekvensering metoder og redusere mengden av nylig transkribert eller oversatt, og føre til uønsket readouts av stressrespons i sekvensering resultatene. Sentrifugering hastigheten nevnt i denne protokollen for pellets celler er optimalisert for primær T-celler. Således, justere hastigheten etter hvilken celle.
4 sU effekter på cellen fysiologi: I tillegg til de nevnte alternativene for å bekrefte minimal forstyrrelsene til mobilnettet fysiologi ved 4sU tillegg, kan ytterligere og/eller flere analyse utføres, spesielt når cellen tallene er begrenset. Effekter på celle spredning kan testes ved å kontrollere dobling tid av celler ved å bare telle med og uten etiketter celler. Nucleolar stress induksjon kunne også bli testet ved å analysere celle morfologi via immunofluorescence farging av nucleolin og kjerner. For å bekrefte effekten av 4sU, kunne endrede globale genuttrykk måles ved å samkjøre lese teller fra merket totale RNA til umerkede totale RNA.
Celle tall: I vitro generert T celler anbefaler vi starter med minst mengden av celler som er angitt i tabell 2. Velg tilstrekkelig antall per metoden i henhold til cellene. Siden T celler har mindre cytoplasma og RNA i forhold til andre celler, vil sannsynligvis lavere mengder av andre celler være tilstrekkelig. For ChIP-seq avhenger cellen tallene svært antistoffer brukt og hvilket uttrykk protein av interesse i cellene. Histone eller RNAPII ChIP, kan fewe celler brukes mens cellen tallene må økes når transkripsjonsfaktorer brukes, spesielt hvis de er uttrykt på lavt nivå.
4 sU-merking og RNA biotinylation: Når du bruker tilhenger celler, kan 4sU merking rettes som beskrevet av Rädle et al. 19 siden celler svært raskt innlemme 4sU, det kan legges direkte til mediet av suspensjon, tilhenger eller semi tilhenger celler.
Det anbefales å starte biotinylation med 60-80 µg av. Likevel lavere mengder av RNA kan brukes, selv om vi ikke teste for mindre enn 30 µg. legge til en coprecipitant (f.eksGlycoBlue) når fremskynde RNA hvis pellet er vanskelig å se. Duffy et al. har også vist at methylthiosulfonate-aktivert biotin (MTS-biotin) mer effektivt reagerer med 4sU-merket RNA enn HPDP-biotin31. Derfor kan det være verdt å vurdere bytte til MTS-biotin, spesielt for utvinning av små RNAs, som pleier å ha færre uridine rester (se biotinylation protokollen nevnt av Duffy et al.; se rensing av 4sU-merket, Eksperimentell prosedyrer).
For utvinningen av nylig transkribere RNA er det mulig å bruke spinn perler eller RNA opprydding perler av ditt valg. Alltid ta hensyn til at disse pakkene kan eller kan ikke rense for bestemte RNAs. For eksempel hvis du er interessert i miRNAs, vurdere å bruke bestemte kits for miRNA fangst og sekvenser.
Kvantifisering av nylig transkribere RNA: For å nøyaktig antall nylig transkribere RNA, måling skal utføres av en egnet fluorometer (se Tabell for materiale). Innen 1 h 4sU eksponering representerer nylig transkribere RNA ca 1-4% av totale. Nylig transkribere RNA på 1 h merket, aktivert T celler består av ~ 90-94% av rRNA11.
Ribosom profilering: Når etablering metoden, vi funnet ut at ved å bruke 1,5 x antall nuclease foreslått i den opprinnelige protokollen garanterer riktig fordøyelse. Også er uten bivirkninger rapportert for forhøyede mengder nuclease. Siden det er ganske vanskelig å overdigest RPFs mens de er del av RNA bundet av ribosomal proteiner, kan du fortsatt litt øke mengden å sjarmere optimale nuclease fordøyelsen.
Hvis mindre enn 500 ng av RPF ble gjenopprettet i trinn 4.4.2, gjenta rRNA uttømming og basseng renset RPFs med RNA Clean & konsentrator-5 kolonner. Alternativt laste to identiske eksempler på gel (trinn 4.5.3) og bassenget gel skiver under RNA elueringsrør fra gel (trinn 4.5.6).
Vi anbefaler kutte RPFs på en gel så tett som mulig til 28 og 30 nt bandene. Dette bidrar i å eliminere uønskede fragmenter fra rRNAs og tRNAs, som senere blir en del av biblioteket og redusere sekvensering leser for din RPFs.
Det anbefales også å unngå UV lys under gel rensing. Dette kan skape kutt i RNA fragmenter, samt pyrimidine dimers, som til slutt kan påvirke biblioteket forberedelse og sekvensering resultater.
Bibliotek forberedelse og sekvensering av data: Ribosom profilering protokollen kan generere et cDNA bibliotek egnet for sekvenser. Prøver generert av 4sU-merking kan direkte brukes for biblioteket forberedelser med alle aktuelle RNA sekvensering kit. Siden nylig transkribere RNA, særlig når benytter kort merking ganger, ikke kan være polyadenylated, skal ingen poly-et utvalg utføres. I stedet anbefaler vi sterkt rRNA uttømming å hindre redusere sekvensering dybde for det faktiske eksemplet. Bruke T-celler, vi startet med 400 ng av nylig transkribert og total (avhengig av settet, se materialer), utført rRNA uttømming og redusert sykluser for PCR forsterkning å minimere PCR bias. Biblioteket forberedelse kan utføres med mindre utgangsmaterialet. Kontoen for biblioteket kompleksitet antall PCR sykluser skal optimaliseres.
For ChIP-seq finnes også mange kits tilgjengelig for biblioteket forberedelse. I våre hender biblioteket forberedelse jobbet godt starter med 2 ng ChIP DNA (se materialer for et forslag som kit å bruke). Husk å sjekke indekser for fargebalansen i sekvenser. Vi anbefaler en sekvensering dybdeskarphet ≥40 x 106 leser hver for 4sU-seq, totalt RNA-seq, og ChIP-seq prøver og ≥80 x 106 leser for ribosom profilering prøver. Sekvensering dybden avhenger prøven og nedstrøms bioinformatikk analysen og bør vurderes nøye. Analysere intronic leser for cotranscriptional skjøting, 100 må bp sammen-end sekvensering velges.
Sekvensering skjevhet: Sekvensering har blitt gullstandarden når globale endringer i transkripsjon, oversettelse eller transkripsjon faktor bindende. I de siste årene, eksisterende metoder ble presset til sine grenser eller nye teknikker ble utviklet for sekvensering stadig mindre Start mengder RNA. Dette krever forsterkning av cDNA, som introduserer støy eller bias. Nylig ble unike molekylær identifikatorer (UMIs) utviklet for å identifisere eksperimentelt duplikater introdusert av PCR. Nylig ble det vist at UMIs bare mildt forbedre sekvensering makt og falske funnrate differensial gene expression32. Imidlertid vurdere å bruke unike molekylær identifikatorer (UMIs) for alle sekvensering bibliotekene å kontroll for biblioteket kompleksitet, spesielt når du starter med lave mengder RNA og ved mange PCR sykluser.
Buffer og lager løsninger: Alle bufferne for 4sU-seq og ribosom profilering må være forberedt under strenge RNase-fri vilkår bruker nuclease-fritt vann. Det anbefales å kjøpe pre-laget nuclease-fri NaCl, Tris-HCl, EDTA, natriumsitrat og vann. For å sikre nuclease-gratis forhold, kan en RNase decontaminating løsning brukes til å rense Pipetter eller overflater. Alle bufferne for ChIP-seq må være minst DNase-fri og kan lagres ved romtemperatur. Alltid legge proteasehemmere og eventuelt fosfatase hemmere rett før bruk og holde på isen.
Bioinformatics: Analyse av alle sekvensering data (dvs., ChIP-seq, RNA-seq og ribsosome profilering) omfatter kvalitetskontroll (f.eksved hjelp av FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), kortet trimming (f.eksmed cutadapt20) etterfulgt av tilordning til referanse genomet til cellene under studien. RNA-seq data (totalt og 4sU-seq), samt ribosom profildata, er en skjøtes RNA-seq-tilordning nødvendig, for eksempel ContextMap 221. For ChIP-seq data unspliced justeringer er bruke BWA-MEM22 tilstrekkelig. Genuttrykk kan beregnes med RPKM modell (leser per Kilobase av Exon per Million fragmenter tilordnet)1, etter bestemme lese teller per genet ved hjelp av et program, f.eks featureCounts23. For topp ringer fra ChIP-seq data, mange programmer er tilgjengelige, f.eks, Mac24 eller perle25. Videre kan nedstrøms analyser utføres i R26, spesielt ved hjelp av verktøy levert av Bioconductor prosjektet27.
Her er en stor utfordring i å integrere 4sU- og totalt RNA nivåer og translasjonsforskning aktivitet fra ribosom profilering normalisering. En klassisk tilnærming til dette problemet er å normalisere for rengjøring gener. For å redusere støy på grunn av tilfeldige svingninger for enkelte rengjøring gener, anbefales det å bruke ikke bare noen rengjøring gener men median nivåer for et større sett, f.eks den > 3000 rengjøring gener utarbeidet av Eisenberg og Levanon28 . Priser (f.eksforutsatt en RNA half-life 5 h)29for beregning av RNA Omsetningshastigheten fra prosenter av 4sU-til totalt RNA, normalisering er basert på median omsetning. Men siden dette forutsetter ingen generelle endringer for rengjøring gener, anbefaler vi bruke analyse tilnærminger uavhengig av normalisering, f.ekskorrelasjon-baserte klynger av en gang-serie med forskjellige datatyper av gener med forskjellige atferd i transkripsjon og oversettelse under aktiveringen. En detaljert beskrivelse på bioinformatical integrering av forskjellige datatyper referere vi til den opprinnelige publikasjon11.
Analyse av omsetning priser og data integrering: En nylig utgitte33 sammenligne halv-liv etter en multiplex gen kontroll (MGC) globale metoder kan vise at halveringstid korrelert beste med de man får av metabolske merking metoder i forhold til andre metoder (f.eks, de generelle hemming av transkripsjon av narkotika). Det bør imidlertid nevnes at forskjellene mellom half-life beregninger kan oppstå og har vært beskrevet 15,34. Vi står for de fleste problemer og forskjellene som er innført av stressrespons på grunn av langvarig 4sU eksponering. Derfor er det uunnværlig å ekskludere stressrespons introdusert av 4sU-merking. Videre validere Omsetningshastigheten, anbefaler vi bruk av MGCs.
I tillegg kunne et datasett generert her også brukes for en mer integrerende data analyse (f.eks, regulering av lenge ikke-koding RNAs)35,36.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Lars Dölken for råd å etablere 4sU merkingsteknikker for primær T-celler; Elisabeth Graf og Thomas Schwarzmayr for kritiske hjelp i biblioteket generasjoner og sekvensering; Dirk Eick og Andrew Flatley for å gi RNAPII og T-celle antistoffer; N. Henriette Uhlenhaut og Franziska Greulich for hjelp i biblioteket forberedelse til ChIP-seq; Caroline C. Friedel ble støttet av tilskudd FR2938/7-1 og CRC 1123 (Z2) fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher ble støttet av stipendet GL 870/1-1 fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) og tysk Center for Diabetes forskning (DZD), Helmholtz Zentrum München.
4sU-labeling | |||
4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
Cell viability and stress assay | |||
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
p53 | abcam | ab26 | Optional |
p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
Buffers | |||
4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
Adaptors for 15 ml tubes | |||
Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
Ribosome Profiling | |||
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
(High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
ChIP | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
Agarose | gereral lab supplier | ||
Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
or antibody of interest | |||
Buffers | |||
Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
Nanodrop | Thermo Scientific | ||
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
or tubes special for your sonication device | |||
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 – 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
Magnetic stand for tubes | |||
Thermomixer | |||
Agarose gel electrophoresis | |||
Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |