Un modelo animal es necesario para descifrar el papel de las células del tumor (CTC) en la promoción de la colonización durante la metástasis del cáncer de pulmón en circulación. Aquí, hemos establecido y realizado con éxito un en vivo ensayo a prueba específicamente el requisito de fibronectina poliméricos (polyFN) Asamblea CTC para la colonización del pulmón.
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Artículo de método
El establecimiento de un ensayo de colonización pulmonar para la visualización de células tumorales en tejidos pulmonares de la circulación
En este artículo
Resumen
Resumen
La metástasis es la principal causa de muerte por cáncer. El papel de la circulación de las células del tumor (CTC) en la promoción de metástasis del cáncer, en el cual la colonización pulmonar por CTC críticamente contribuye a principios procesos metastásicos de pulmón, se ha investigado vigorosamente. Así, los modelos animales son el único enfoque que captura el proceso completo sistémico de metástasis. Teniendo en cuenta que tiene problemas en los diseños experimentales para examinar las contribuciones de CTC a la extravasación de los vasos sanguíneos, se estableció un ensayo de colonización en vivo pulmón en que a largo plazo la fluorescencia de la célula-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE), fue utilizado para identificar células tumorales suspendido y perfusión del pulmón fue realizada para claro no específicamente atrapado CTC antes de la extirpación de pulmón, proyección de imagen confocal y la cuantificación. Polimérico fibronectina (polyFN) montado en superficies CTC se ha encontrado para mediar la colonización del pulmón en el establecimiento final de los tejidos del tumor metastásico. Aquí, para probar específicamente el requisito de polyFN Asamblea CTC para la colonización del pulmón y la extravasación, se realiza a corto plazo ensayos de colonización pulmonar en el cual suspendieron Lewis lung carcinoma células (SRL) estable expresan FN-shRNA (shFN) o despegue en tiempo mínimo-shRNA (shScr) y previamente con 20 μM de CFSE fueron inoculados por vía intravenosa en ratones C57BL/6. Hemos demostrado con éxito que las capacidades de las células LLC shFN para colonizar los pulmones de ratón fueron disminuidas significativamente en comparación con las células LLC de shScr. Por lo tanto, esta metodología a corto plazo puede ser ampliamente aplicada para demostrar específicamente la capacidad de CTC dentro de la circulación para colonizar los pulmones.
Introducción
La metástasis es la principal causa de muerte de cáncer1,2. Las células tumorales derivadas de tejidos primarios entrar en la circulación en suspensión y sobreviven varios desafíos hematógenas, por ejemplo, anoikis, inmunes agresiones y daños debido a la tensión de esquileo de la tensión arterial o las limitaciones geométricas, antes de que se capaz de colonizar órganos distantes, un paso clave que dicta el éxito de metástasis3,4,5,6. Por lo tanto, actualmente se han hecho e....
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Protocolo
Todos los experimentos en ratones fueron realizados según las directrices de nuestro Instituto (la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, NCKU Medical College).
1. preparación de instrumentos, medios de cultivo y platos
- Antes de iniciar los protocolos experimentales, obtener suturas quirúrgicas estériles, jeringas de 1 mL con aguja de 26G/0,5 cm (para la cola inyección en la vena), jeringas de 3 mL con aguja 24G/3 cm (para el pulmón de la perfusión), modificado Eagle Media (DMEM de Dulbecco), solución de tripsina-EDTA (5 Contabilidad tripsina y 0,53 mM), suero bovino fetal (FBS), 1 x PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 1....
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Resultados
Antes de realizar el ensayo de colonización en vivo pulmón como se ilustra en la figura 1A para probar si polyFN en las células del tumor suspendido media colonización pulmonar o extravasación en la facilitación de metástasis, lo primero graduado diferentes concentraciones de CFSE, un compuesto fluorescente que es célula permeable y covalente conjuga intracelular que contiene amina moléculas26,27
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Discusión
Junto a largo plazo pulmonar colonización ensayos, corto plazo metodología empleamos aquí evaluar en vivo pulmón colonización por CTC en órganos distantes claramente dio a conocer y distingue el papel específico de polyFN montado en CTC en colonización los pulmones, que luego condujeron a la extravasación y procesos metastásicos18,19,20,21. Aunque etiquetado células con rastreador de c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Chang Ming-Min y Ya-Hsin contactar su soporte técnico. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de ciencia y tecnología de Taiwán (la mayoría-103-2325-B-006-009, la mayoría-104-2325-B-006-001, la mayoría-105-2325-B-006-001 y MOST-106-2320-B-006-068-MY3) y el Ministerio de salud y bienestar (MOHW106-TDU-B-211-144004). Agradecemos también el apoyo del laboratorio de investigación central de la Facultad de medicina de la Universidad Nacional Cheng Kung, su microscopio confocal del multi-photon.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Albúmina sérica bovina ( BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwán) | 101-9048-46-8 | |
| Fluido de Bouin | MCC (corporación química médica)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Nombre completo: Carboxifluoresceína succinimidil éster |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwán) | 101-6381-92-6 | Para solución preparada de tripsina-EDTA (concentración final: 0,53 mM) |
| Suero fetal bovino (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) | ATCC, Manassas, VA, EE. UU | CRL-1642 | |
| L-Glutamina, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Cyrusbioscience (Taipéi, Taiwán) | 101-7447-40-7 | Para preparado 1X PBS ( Concentración final: 2,7 mM ) |
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipéi, Taiwán) | 101-7778-77-0 | Para preparado 1X PBS ( Concentración final: 1,8 mM ) |
| Sodio cloruro (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwán) | 101-7647-14-5 | Para preparado 1X PBS ( Concentración final: 137mM ) |
| Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwán) | 101-10039-32-4 | Para preparado 1X PBS ( Concentración final: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0,5 g mezcla con 100 mL 1X PBS |
| Tripsina | Sigma Aldrich | T4799 | Para la solución preparada de tripsina-EDTA ( Concentración final: 5 g / L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | Para diluir con 1X PBS | |
| Nombre | >Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Equipo | |||
| Centrífuga de mesa compacta 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Plato de cultivo (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | ||
| Jeringa desechable (con aguja) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| Mezclador de extremo a extremo | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | Para la recuperación de células en suspensión |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences Pinzas | ||
| Dimeda | 10.102.14 | ||
| Forma Calor Directo CO2 | incubadora Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Bloqueador de ratón (Protector cilíndrico 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Microscopio confocal multifotónico BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Cámara de recuento Neubauer | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Tijera quirúrgica | Dimeda | 08.370.11 | |
| Suturas quirúrgicas | SUTURAS QUIRÚRGICAS UNIK MFG. CO. | NO. 0034 | Negro Seda trenzada; no absorbible (25 yardas; U.S.P. 4/0) |
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | Wuxi NEST Biotechnology Co. | ||
| tubo Greiner de 15 mL | Greiner bio-one | 188271 |
Referencias
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K.
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Reimpresiones y permisos
