Eksponering for miljømæssige giftige stoffer kan akut påvirke udviklingen med langsigtede virkninger. Detaljerede protokoller leveres til at illustrere en strategi ved hjælp af en effektiv lab model til at studere effekten af tidlig embryonale udsættelse for bisphenol A. Vi leverer frugtbarhed og adfærdsmæssige assays til at overvåge effektiviteten af vores giftstof eksponering bio-assays.
Uvæsentligt, såsom bisphenol A (BPA) og bisphenol S (BPS) polymeriserende agenter almindeligt anvendt i produktion af plast og talrige hverdagens brug produkter. Baseret på deres kemiske struktur og østradiol-lignende biologiske egenskaber, er de blevet klassificeret som hormonforstyrrende stoffer (EDC). Langvarig eksponering for EDC, selv ved lave doser, har været knyttet til forskellige sundhed defekter, herunder kræft, adfærdsmæssige forstyrrelser og barnløshed, med større sårbarhed angivet i tidlige udviklingsmæssige perioder. Cellulære og molekylære undersøgelser med genetisk tractable ødelægge model Caenorhabditis elegans har vist, at udsættelse for BPA forårsager apoptose, embryonale dødelighed og forstyrrelser i DNA reparation mekanismer. Vi har tidligere rapporteret at eksponering af C. elegans embryoner til lave doser af forskellige uvæsentligt nedsætter frugtbarhed. Derudover har vi vist at virkninger af eksponering i de meget tidlige stadier af udvikling persistere ind i voksenalderen, som analyseres af kvantificere tilvænning adfærd, en form for associative læring. Her, leverer vi detaljerede protokoller for embryonale eksponering for lav-dosis EDC samt de tilknyttede frugtbarhed og anterior touch tilvænning assays, sammen med repræsentative resultater.
Udsættelse for miljøområdet giftstoffer, forbindelser især dem, der har tendens til at blande sig med udvikling, har været under grundig videnskabelig undersøgelse i de seneste år. Mere end 1000 kemikalier i daglig brug er klassificeret som hormonforstyrrende stoffer (EDC)1. Perioder med hurtig vækst og udvikling, som omfatter embryonale, spædbarn og barndom faser, har konstateret for at være særligt sårbare over for de skadelige virkninger for selv lav-dosis EDC. Deres virkning har vist sig at forårsage reproduktive og Neuro-udviklingsmæssige forstyrrelser2. Per retningslinjerne US Environmental Protection Agency og os nationale toksikologi Program panelet kan en lav dosis defineres som enhver dosis under niveauet for en, der er blevet rapporteret at forårsage en observerbar biologiske forandringer eller skader3. Udover lav-dosis virkninger af enkelte EDC har blandinger af forskellige EDC fundet ved lave koncentrationer i miljøet potentiale til at forårsage væsentlige kumulative virkninger4.
Bisphenol A (BPA eller 4,4′-(propane-2,2-diyl)) er en polymerizing agent findes i almindeligt brugte elementer som vand flasker, butik kvitteringer, dental fugemasser og foringer af drikkevarer og fødevarer dåser5. På grund af sin strukturelle lighed med 17-β Estradiol (E2) og sin affinitet til ERα og ERβ østrogenreceptorer, er BPA blevet klassificeret som en hormonforstyrrende kemiske (EDC)5,6. Selvom svagere, har BPAS affinitet til østrogen-receptorer vist sig at påvirke reproduktion system af begge køn og forstyrre neurale funktioner ved doser, der anses for sikkert7,8. For at forårsage langsigtede neuronal defekter i mus udsat for BPA9observeret ændringer i DNA methylering via epigenetically regulerede mekanismer. Specifikt, har BPA også været impliceret som en mulig synder for større procentdel af hyperaktivitet, opmærksomhed mangel og øget følsomhed over for narkotika på grund af en stigning set i D1 dopamin receptorer i mus limbiske forhjernen efter kronisk eksponering 9 , 10. væsentlige beviser om EDC skadelige virkninger på menneskers sundhed er baseret på korrelation undersøgelser fokuserer hovedsageligt på kronisk eksponering af befolkningen til miljømæssige giftstoffer selv ved lave doser5; dog er begrænsninger i slutninger fra humane undersøgelser og manipulere eksperimentelle kontrolelementer blevet accepteret at løse kritik af udokumenterede hype11,12.
På grund af bevarelsen af Caenorhabditis elegans’ gener med hensyn til pattedyr, herunder dens steroid hormon-receptor gener, forskere har udnyttet denne genetisk tractable lab model for at optrævle de funktionelle og mekanistiske virkninger af EDC 13. eksperimenter med C. elegans har vist, at disse stoffer som BPA og BPS kan forårsage apoptose, embryonale dødelighed, forstyrrelser i dobbelt-strenget DNA pause reparation mekanismer og neurale funktion14,15 ,16.
Vores lab har tidligere vist, at selv lavdosis udsættelse begrænset til tidlige embryogenese fører til nedsat fertilitet med adfærdsmæssige underskud i de overlevende voksne15. Tilvænning til en gentagen stimulus er en form for associative læring i modelsystemer, herunder C. elegans, og vores metode bruger denne form for associative læring som en adfærdsmæssige output til assay de langsigtede virkninger af embryonale eksponering for giftige stoffer17 specifikt, vi leverer detaljerede protokoller for at studere BPA eksponering på C. elegans, herunder dens umiddelbare virkninger på embryonale dødelighed og langsigtede virkninger på voksen adfærd, med en samlet skematisk afbildet i Figur 1. Repræsentative resultater fra frugtbarhed og associative læring assays er forudsat for at fremhæve effektiviteten af vores metodologi.
Faser af hurtig vækst og udvikling såsom embryogenese er særligt sårbare over for de skadelige virkninger af forskellige hormonforstyrrende stoffer, herunder BPA. Vi leverer detaljerede protokoller for at studere virkningerne af eksponering for BPA eller andre giftige stoffer i C. elegans hvirvelløse model, som giver mulighed for bekvem titrering af en række koncentrationer at vurdere dens virkninger på embryo levedygtighed (figur 2) . Følge op på adfærdsmæssige eksperimenter på overlevende voksne, der udvikler fra embryoner, blev udsat for lave doser af BPA tillade boltpistoler langtidseffekter på neuronal funktion (figur 3). Den centrale idé i dette papir er at give detaljerede protokoller for udsætter embryoner til forskellige giftstoffer i den tidlige embryogenese periode i C. elegans model; de første 4 h vindue i sine 11,5 time fosterudviklingen periode (ved 20 ° C) svarer til perioden spredning, som er efterfulgt af organogenesis. I denne retning, har vi givet validering af slutpunkter gennem frugtbarhed og associative læring assays. Mens den mekanistiske grundlag af virkningen af BPA og andre uvæsentligt er den hellige gral som forskning på dette område har til formål, har vi ikke forsøg på at tilbyde en mekanistisk forklaring på virkningen af BPA i denne metode fokuseret artikel. Vi vil dog gerne påpege, at C. elegans modellen tilbyder et ideelt system for at yderligere dissekere virkningsmekanisme. For eksempel, i fremtiden arbejde på decifrere BPA virkningsmekanismer, C. elegans mutanter kan genereres og screenes for en modstand mod virkningerne af BPA og dermed bane vejen for decifrere vej. Derudover omhandler vores følgesvend papir effekt af BPA på neurale netværk synchrony niveau i hvirveldyr, giver en anden avenue for at forstå grundlaget for at undersøge potentielle mekanismer for giftstof effekter19.
I den metode, der beskrevet i dette papir, nogle af de vigtige skridt, der skal udføres ekstra omhyggeligt, omfatter følgende: at vælge en plade med velnærede C. elegans voksne med modne æg synlige mikroskopet dissektion er afgørende, og ikke at følge dette trin vil resultere i en utilstrækkelig stikprøvestørrelse af embryoner til EDC eksponering eksperiment. Det er også vigtigt at sørge for, at den hypokloritiske løsning er frisklavet undgå at få en ikke-synkroniserede befolkning, der vil forstyrre evnen til at udføre BPA eksponering under tidlige embryogenese. Vask pellets med M9 (efter hypokloritiske eksponering) er også et meget vigtigt skridt. Hvis det ikke gøres ordentligt, kan den høje koncentration af blegemiddel resultere i døde embryoer. Derudover skal embryoner overføres til seedede NGM plader efter 4 h. Hvis venstre i BPA løsning for en længere periode, er at embryonerne tilbøjelige til at udvikle til langlivede dauer larver. Dette påvirker væsentligt frugtbarhed assay og adfærdsmæssige assays. Hvis nogen af disse skridt er savnet, er det tilrådeligt at starte proceduren helt fra begyndelsen. Hvis en eller anden grund, NGM plade med orme er forurenet eller ikke har nok mad, vil det tilføje stress på ormene dermed skævvridning de indsamlede data. Sådanne plader skal kasseres og anvendes ikke i forsøget.
Tidligere, en bemærkelsesværdig undersøgelse med held brugt C. elegans model for at demonstrere at kromosom abnormiteter forårsaget af BPA resultat på grund af fordelingen af DNA reparation maskiner i kønscelleoverførsel14. Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at den ovennævnte undersøgelse design havde brugt kontinuerlig BPA eksponering af C. elegans høje doser af BPA i hele dens levetid. Vores metode var designet til at studere lave doser af BPA eksponering under tidlige embryogenese, således at analysen dens virkninger på embryonale levedygtighed og finere langtidseffekter på overlevende. Til vores viden, er ingen metode blevet udviklet for at afsløre tidlige fase embryoner til meget lave doser af BPA begrænset til en bestemt periode; således præsenteres gør metoden her roman.
Derudover leveres protokoller, her kan være let tilpasses til at undersøge virkningerne af andre EDC fasen spredning af embryogenese. Men for at studere sent vorden, protokollen vil kræve afgørende ændringer til vinduet kritisk tidspunkt udvikling under fokus. Desuden vil vores protokol ikke være egnet til eksperimenter der kræver længere perioder med giftstof eksponering, da det åbner mulighed for alternative udvikling pathway resulterer i langlivede dauer anholdelse på den anden molting cyklus, som er resistente til barske betingelser20. Yderligere ændringer og forbedringer vil være behov for længere eksponeringstider gennem supplement med en fødekilde, der ikke har potentiale til at metabolisere giftstoffet eller EDC fx autoklaveres E. coli. Afslutningsvis, vores metodologi kan udnyttes til at vurdere virkningerne af forskellige hormonforstyrrende kemikalier på frugtbarheden og neuronal funktion i ordningen hvirvelløse model C. elegans.
The authors have nothing to disclose.
Støtte af NSF (EPSCoR EPS-0814251) og NIH (1P20GM103653-01A1) til MKT og HSD, Delaware State Universitys institutionelle studentersupport MDM (afsnit III HBGI) og KRS (NIH-INBRE) anerkendes taknemmeligt. Tak til C. elegans genetisk Center (støttet af forskning infrastruktur programmer P40 OD010110 NIH kontor) for C. elegans vildtype N2 stamme.
NaCl | Fisher | 7647-14-5 | |
Peptone | Fisher | S25761B | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
MgSO4 | Fisher | 7487-88-9 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
KH2PO4 | Fisher | P286-1 | |
K2HPO4 | Fisher | 7758-11–4 | |
KOH | Fisher | 1310-58-3 | |
Bleach | Clorox | n/a | |
Na2HPO4 | Fisher | BP332-500 | |
LB | Fisher | BP1426-500 | |
BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
BPS | Sigma-Aldrich | 103039-100g | |
EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
E.coli OP50 | CGC | Repository at U of Minnesota | |
N2 (Wild-type C. elegans) worms | CGC | Repository at U of Minnesota | |
Platinum wire pick | Genesee Scientific | 59-AWP | |
Petri plates | Fisher | 07-202-011 | |
Dissection Microscope | AmScope | SM-2TYY |