Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca2 + transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.
Calcium (Ca2 +) imaging is een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken de spatio dynamiek van intracellulaire Ca2 + signalen in neuronale dendrites. CA2 + schommelingen kunnen optreden door een verscheidenheid van membraan en intracellulaire mechanismen en een cruciale rol in de inductie van synaptische plasticiteit en regulering van dendritische prikkelbaarheid. Vandaar is de mogelijkheid om verschillende soorten Ca2 + signalen opnemen in dendritische takken waardevol voor groepen bestuderen hoe dendrites informatie integreren. De komst van twee-foton microscopie heeft dergelijke studies aanzienlijk gemakkelijker gemaakt door het oplossen van de problemen die inherent zijn aan imaging in levend weefsel, zoals lichtverstrooiing en photodamage. Bovendien, door de combinatie van conventionele elektrofysiologische technieken met twee-foton Ca2 + imaging, is het mogelijk te onderzoeken van lokale Ca2 + schommelingen in neuronale dendrites parallel met opnames van synaptic activiteit in Soma. Hier beschrijven we hoe gebruiken deze methode voor de analyse van de dynamiek van lokale Ca2 + transiënten (katten) in dendrites van GABAergic remmende interneuronen. De methode kan ook worden toegepast op het bestuderen van dendritische Ca2 + signalering in verschillende neuronale in acute hersenen plakjes.
De bijdrage van een neuron netwerk activiteit wordt grotendeels bepaald door de dynamische aard van de synaptische ingangen die zij ontvangt. Traditioneel, vertrouwd de overheersende methode van karakterisering van synaptic activiteit in de neuronen op somatische geheel-cel patch-clamp opnames van postsynaptisch stromingen opgeroepen door elektrische stimulatie van de axonen van passage. Echter is enige activiteit van de synapsen in de proximally gelegen naar waarheid gerapporteerd in dit geval1. Bovendien, om te beoordelen de synapse-specifieke mechanismen, zijn opnames uit paren van neuronen en dendrites op een specifieke locatie gebruikt te richten op de synapsen van belang en de mechanismen van dendritische integratie, respectievelijk. Een belangrijke doorbraak op het gebied van synaptic fysiologie werd bereikt door een huwelijk van optische en elektrofysiologische technieken. Twee-foton excitatie laser scanning microscopie (2PLSM) in combinatie met Ca2 + beeldvorming en optogenetic tools kan onthullen enorme details voor de dynamische organisatie van synaptic activiteit op bepaalde neuronale verbindingen in de hersenen segmenten, in vitro en in vivo.
Verschillende belangrijke voordelen gemaakt 2PLSM onderscheiden van de conventionele, één-foton excitatie microscopie2: (1) als gevolg van een niet-lineaire aard van twee-foton excitatie, de fluorescentie wordt alleen gegenereerd bij het focal volume en alle uitgestoten fotonen vertegenwoordigen nuttige signalen (geen noodzaak voor gaatje); (2) langere golflengten, gebruikt in 2PLSM, dringen het weefsel van de verstrooiing efficiënter; Daarnaast zijn verstrooide fotonen ook verdund tot twee-foton excitatie en achtergrond fluorescentie; (3) photodamage en fototoxiciteit zijn ook beperkt tot het brandvlak. Ondanks de hoge kosten van 2-foton systemen in vergelijking met conventionele confocal microscopen blijft de 2PLSM daarom een methode van keuze voor hoge resolutie onderzoek van neuronale structuur en functie in dikke levend weefsel.
De eerste toepassing van 2PLSM in de verstrooiing weefsel was om het imago van de structuur en functie van dendritische spines3. 2PLSM in combinatie met Ca2 + imaging heeft geopenbaard die stekels functie als geïsoleerde biochemische compartimenten. Aangezien er in neuronale verschillende een-op-een correspondentie tussen stekels en individuele synapsen4, werd twee-foton Ca2 + imaging spoedig een nuttig instrument rapportage van de activiteiten van individuele synapsen in onbeschadigde weefsel5, 6,7,8. Bovendien werd 2PLSM gebaseerde Ca2 + imaging met succes gebruikt om de activiteit van één calcium kanalen en de niet-lineaire interacties tussen de intrinsieke en synaptische conductances te controleren, alsmede om te beoordelen van de staat – en activiteiten-afhankelijk verordening van Ca2 + signalering in neuronale dendrites5,6,7,8,9,10,11.
Calcium is een alomtegenwoordige intracellulaire tweede boodschapper, en haar subcellular Spatio organisatie bepaalt de richting van fysiologische reacties, van veranderingen in synaptic kracht om de regulering van de ion kanalen, dendriet en wervelkolom groei, als evenals celdood en overleving. Dendritische Ca2 + waterstand optreden via activatie van meerdere trajecten. Actie potentials (APs), backpropagating naar de dendrites, open spanning-gated calcium kanalen12 en relatief global Ca2 + transiënten (katten) produceren in dendrites en stekels13. Synaptische transmissie wordt geassocieerd met de activering van postsynaptisch Ca2 +-permeabele receptoren (NMDA, Ca2 +-permeabele AMPA en kainate),6,14,15triggering synaptic katten. Tot slot worden supralinear Ca2 + gebeurtenissen gegenereerd in de dendrites onder bepaalde voorwaarden11,12,13,16.
Twee-foton Ca2 + imaging in combinatie met patch-clamp elektrofysiologische opnames maakt gebruik van synthetische Ca2 +-gevoelige fluorescerende indicatoren, die meestal worden geleverd door de patch elektrode tijdens geheel-cel opnames . Een standaardmethode voor kwantificering van Ca2 + dynamiek is gebaseerd op de dual indicator methode17,18. Het maakt gebruik van twee fluorophores met goed gescheiden emissie spectra (bijvoorbeeld, een combinatie van een rode Ca2 +-ongevoelig kleurstof met groene Ca2 + indicatoren, zoals de Oregon groene BAPTA-1 of Fluo-4) en heeft een aantal voordelen in vergelijking met de enkele indicator methode. Ten eerste, een Ca2 +-ongevoelig kleurstof wordt gebruikt om te zoeken van kleine structuren van belang (dendritische takken en stekels) waar Ca2 + beeldvorming zal worden uitgevoerd. Ten tweede, de verhouding tussen de verandering in de groene en rode fluorescentie (ΔG/R) wordt berekend als een maatregel voor [Ca2 +], die grotendeels ongevoelig is voor veranderingen in de basislijn fluorescentie als gevolg van fluctuaties in [Ca2 +]017 , 18. Bovendien fluorescentie wijzigingen in termen van absolute Ca2 + concentraties19kunnen worden gekalibreerd.
Een algemene bezorgdheid wanneer twee-foton Ca2 + imaging experimenten uitgevoerd in acute segmenten is cell gezondheid en stabiliteit van de image aquisition toe te schrijven aan de kracht van de hoge laser meestal gebruikt. Bovendien, in Ca2 + imaging experimenten bestaat er bezorgdheid over de verstoring en de aanzienlijke overschatting van subcellular Ca2 + dynamiek wijten aan het feit dat Ca2 + indicatoren als uiterst mobiele exogene Ca2 fungeren + buffers. Dus, de keuze van de Ca2 + indicator en de concentratie ervan hangt af van de neuronale type, de verwachte amplitude van katten, en de experimentele vraag.
Aangepast we de methode voor twee-foton Ca2 + imaging voor onderzoek van Ca2 + schommelingen in de dendrites van GABAergic interneuronen9,10,11,20,21 , 22. terwijl het grootste deel van de vroege Ca2 + imaging studies werden gedaan in de belangrijkste neuronen, remmende interneuronen vitrine een grote verscheidenheid aan functionele Ca2 + mechanismen die gescheiden zijn van die in de piramidale cellen20 , 23 , 24. deze interneuron-specifieke mechanismen (bijvoorbeeld, Ca2 + permeabele AMPA receptoren) kunnen spelen specifieke rollen bij het reguleren van de activiteit van de cel. Terwijl dendritische Ca2 + signalering in interneuronen een verleidelijk doelwit voor verder onderzoek is, presenteert twee-foton Ca2 + beeldvorming in de dendrites van deze cellen extra uitdagingen, van een dunnere diameter van dendrites en gebrek aan stekels aan een bijzonder hoge endogene Ca2 + bindingscapaciteit. Als ons onderzoek focus op de studie van hippocampal interneuronen luchtvaartbedrijven, werd het volgende protocol, terwijl die van toepassing zijn verschillende neuronale populaties, aangepast om te gaan met deze uitdagingen.
Dit protocol was uitgevoerd met een commerciële confocal twee-foton microscoop, die was uitgerust met twee externe, niet-descanned detectoren (NDDs), elektro-optische modulator (EOM), en een Dodt scannen kleurovergang contrast (SGC), en geïnstalleerd op een optische tafel. De Microscoop ging gepaard met een Ti:Sapphire multiphoton laser modus-vergrendeld bij 800 nm (> 3 W, 140 fs pulsen, 80 Hz herhaling tarief). De imaging systeem was uitgerust met een standaard electrofysiologie tuig, met inbegrip van een kamer van de perfusie met temperatuurregeling, een vertalen platform met twee micromanipulators, een computergestuurde micro-elektrode-versterker, een digitizer, een stimulatie eenheid, en de software van de overname van de gegevens.
De methode hieronder laat zien hoe de combinatie van de twee-foton Ca2 + beeldvorming en patch-clamp electrofysiologie kan worden gebruikt voor het bestuderen van dendritische Ca2 + signalering in neuronale dendrites in acute hersenen plakjes. Deze methode zorgt voor het toezicht op zowel de lokale Ca2 + verhogingen die door elektrische stimulatie of backpropagating AP in dendritische segmenten, en van de cel somatische reactie opgeroepen. Dit maakt het een uitstekend hulpmiddel om te bes…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek, natuurwetenschappen en techniek onderzoek Raad (Grant van de ontdekking van de NSERC) en de Stichting van Savoye. OC werd gesteund door een Ph.D. fellowship van NSERC.
Animal Strain: Mouse CD1 | Charles River | 022 | |
Isoflurane | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
CGP 55845 hydrochloride | Abcam | ab120337 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium gluconate | Sigma-Aldrich | P1847 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71643 | |
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich | S9638 | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Alexa Fluor 594 Hydrazide | ThermoFisher Scientific | A10438 | |
SR95531 (Gabazine) | Abcam | ab120042 | |
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris |
Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosine (GTP)-Na+ |
Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 |
ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphocreatine di(tris) salt |
Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-conjugated Alexa-546 |
ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Patch Borosilicate Glass Capillaries |
World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilicate Glass Capillaries |
Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller |
Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope |
Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser |
Coherent | ||
LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperature Controller TC-324B |
Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Amplifier |
Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer |
Molecular Devices | ||
Confocal Translator |
Siskiyou | ||
Micromanipulator |
Siskiyou | ||
pClamp Data Acquisition Software |
Molecular Devices | ||
A365 Constant Current Stimulus Isolator |
World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optical Table |
Kinetic Systems |