Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Summary

Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca^{2 +} transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.

Abstract

Calcium (Ca^{2 +}) imaging is een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken de spatio dynamiek van intracellulaire Ca^{2 +} signalen in neuronale dendrites. CA^{2 +} schommelingen kunnen optreden door een verscheidenheid van membraan en intracellulaire mechanismen en een cruciale rol in de inductie van synaptische plasticiteit en regulering van dendritische prikkelbaarheid. Vandaar is de mogelijkheid om verschillende soorten Ca^{2 +} signalen opnemen in dendritische takken waardevol voor groepen bestuderen hoe dendrites informatie integreren. De komst van twee-foton microscopie heeft dergelijke studies aanzienlijk gemakkelijker gemaakt door het oplossen van de problemen die inherent zijn aan imaging in levend weefsel, zoals lichtverstrooiing en photodamage. Bovendien, door de combinatie van conventionele elektrofysiologische technieken met twee-foton Ca^{2 +} imaging, is het mogelijk te onderzoeken van lokale Ca^{2 +} schommelingen in neuronale dendrites parallel met opnames van synaptic activiteit in Soma. Hier beschrijven we hoe gebruiken deze methode voor de analyse van de dynamiek van lokale Ca^{2 +} transiënten (katten) in dendrites van GABAergic remmende interneuronen. De methode kan ook worden toegepast op het bestuderen van dendritische Ca^{2 +} signalering in verschillende neuronale in acute hersenen plakjes.

Introduction

De bijdrage van een neuron netwerk activiteit wordt grotendeels bepaald door de dynamische aard van de synaptische ingangen die zij ontvangt. Traditioneel, vertrouwd de overheersende methode van karakterisering van synaptic activiteit in de neuronen op somatische geheel-cel patch-clamp opnames van postsynaptisch stromingen opgeroepen door elektrische stimulatie van de axonen van passage. Echter is enige activiteit van de synapsen in de proximally gelegen naar waarheid gerapporteerd in dit geval¹. Bovendien, om te beoordelen de synapse-specifieke mechanismen, zijn opnames uit paren van neuronen en dendrites op een specifieke locatie gebruikt te richten op de synapsen van belang en de mechanismen van dendritische integratie, respectievelijk. Een belangrijke doorbraak op het gebied van synaptic fysiologie werd bereikt door een huwelijk van optische en elektrofysiologische technieken. Twee-foton excitatie laser scanning microscopie (2PLSM) in combinatie met Ca^{2 +} beeldvorming en optogenetic tools kan onthullen enorme details voor de dynamische organisatie van synaptic activiteit op bepaalde neuronale verbindingen in de hersenen segmenten, in vitro en in vivo.

Verschillende belangrijke voordelen gemaakt 2PLSM onderscheiden van de conventionele, één-foton excitatie microscopie²: (1) als gevolg van een niet-lineaire aard van twee-foton excitatie, de fluorescentie wordt alleen gegenereerd bij het focal volume en alle uitgestoten fotonen vertegenwoordigen nuttige signalen (geen noodzaak voor gaatje); (2) langere golflengten, gebruikt in 2PLSM, dringen het weefsel van de verstrooiing efficiënter; Daarnaast zijn verstrooide fotonen ook verdund tot twee-foton excitatie en achtergrond fluorescentie; (3) photodamage en fototoxiciteit zijn ook beperkt tot het brandvlak. Ondanks de hoge kosten van 2-foton systemen in vergelijking met conventionele confocal microscopen blijft de 2PLSM daarom een methode van keuze voor hoge resolutie onderzoek van neuronale structuur en functie in dikke levend weefsel.

De eerste toepassing van 2PLSM in de verstrooiing weefsel was om het imago van de structuur en functie van dendritische spines³. 2PLSM in combinatie met Ca^{2 +} imaging heeft geopenbaard die stekels functie als geïsoleerde biochemische compartimenten. Aangezien er in neuronale verschillende een-op-een correspondentie tussen stekels en individuele synapsen⁴, werd twee-foton Ca^{2 +} imaging spoedig een nuttig instrument rapportage van de activiteiten van individuele synapsen in onbeschadigde weefsel^{5, 6,7,8}. Bovendien werd 2PLSM gebaseerde Ca^{2 +} imaging met succes gebruikt om de activiteit van één calcium kanalen en de niet-lineaire interacties tussen de intrinsieke en synaptische conductances te controleren, alsmede om te beoordelen van de staat – en activiteiten-afhankelijk verordening van Ca^{2 +} signalering in neuronale dendrites^{5,6,7,8,9,10,11}.

Calcium is een alomtegenwoordige intracellulaire tweede boodschapper, en haar subcellular Spatio organisatie bepaalt de richting van fysiologische reacties, van veranderingen in synaptic kracht om de regulering van de ion kanalen, dendriet en wervelkolom groei, als evenals celdood en overleving. Dendritische Ca^{2 +} waterstand optreden via activatie van meerdere trajecten. Actie potentials (APs), backpropagating naar de dendrites, open spanning-gated calcium kanalen¹² en relatief global Ca^{2 +} transiënten (katten) produceren in dendrites en stekels¹³. Synaptische transmissie wordt geassocieerd met de activering van postsynaptisch Ca^{2 +}-permeabele receptoren (NMDA, Ca^{2 +}-permeabele AMPA en kainate),^6,14,15triggering synaptic katten. Tot slot worden supralinear Ca^{2 +} gebeurtenissen gegenereerd in de dendrites onder bepaalde voorwaarden^11,12,13,16.

Twee-foton Ca^{2 +} imaging in combinatie met patch-clamp elektrofysiologische opnames maakt gebruik van synthetische Ca^{2 +}-gevoelige fluorescerende indicatoren, die meestal worden geleverd door de patch elektrode tijdens geheel-cel opnames . Een standaardmethode voor kwantificering van Ca^{2 +} dynamiek is gebaseerd op de dual indicator methode^17,18. Het maakt gebruik van twee fluorophores met goed gescheiden emissie spectra (bijvoorbeeld, een combinatie van een rode Ca^{2 +}-ongevoelig kleurstof met groene Ca^{2 +} indicatoren, zoals de Oregon groene BAPTA-1 of Fluo-4) en heeft een aantal voordelen in vergelijking met de enkele indicator methode. Ten eerste, een Ca^{2 +}-ongevoelig kleurstof wordt gebruikt om te zoeken van kleine structuren van belang (dendritische takken en stekels) waar Ca^{2 +} beeldvorming zal worden uitgevoerd. Ten tweede, de verhouding tussen de verandering in de groene en rode fluorescentie (ΔG/R) wordt berekend als een maatregel voor [Ca^{2 +}], die grotendeels ongevoelig is voor veranderingen in de basislijn fluorescentie als gevolg van fluctuaties in [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. Bovendien fluorescentie wijzigingen in termen van absolute Ca^{2 +} concentraties¹⁹kunnen worden gekalibreerd.

Een algemene bezorgdheid wanneer twee-foton Ca^{2 +} imaging experimenten uitgevoerd in acute segmenten is cell gezondheid en stabiliteit van de image aquisition toe te schrijven aan de kracht van de hoge laser meestal gebruikt. Bovendien, in Ca^{2 +} imaging experimenten bestaat er bezorgdheid over de verstoring en de aanzienlijke overschatting van subcellular Ca^{2 +} dynamiek wijten aan het feit dat Ca^{2 +} indicatoren als uiterst mobiele exogene Ca^{2 fungeren +} buffers. Dus, de keuze van de Ca^{2 +} indicator en de concentratie ervan hangt af van de neuronale type, de verwachte amplitude van katten, en de experimentele vraag.

Aangepast we de methode voor twee-foton Ca^{2 +} imaging voor onderzoek van Ca^{2 +} schommelingen in de dendrites van GABAergic interneuronen^{9,10,11,20,21 , 22}. terwijl het grootste deel van de vroege Ca^{2 +} imaging studies werden gedaan in de belangrijkste neuronen, remmende interneuronen vitrine een grote verscheidenheid aan functionele Ca^{2 +} mechanismen die gescheiden zijn van die in de piramidale cellen^{20 , 23 , 24}. deze interneuron-specifieke mechanismen (bijvoorbeeld, Ca^{2 +} permeabele AMPA receptoren) kunnen spelen specifieke rollen bij het reguleren van de activiteit van de cel. Terwijl dendritische Ca^{2 +} signalering in interneuronen een verleidelijk doelwit voor verder onderzoek is, presenteert twee-foton Ca^{2 +} beeldvorming in de dendrites van deze cellen extra uitdagingen, van een dunnere diameter van dendrites en gebrek aan stekels aan een bijzonder hoge endogene Ca^{2 +} bindingscapaciteit. Als ons onderzoek focus op de studie van hippocampal interneuronen luchtvaartbedrijven, werd het volgende protocol, terwijl die van toepassing zijn verschillende neuronale populaties, aangepast om te gaan met deze uitdagingen.

Dit protocol was uitgevoerd met een commerciële confocal twee-foton microscoop, die was uitgerust met twee externe, niet-descanned detectoren (NDDs), elektro-optische modulator (EOM), en een Dodt scannen kleurovergang contrast (SGC), en geïnstalleerd op een optische tafel. De Microscoop ging gepaard met een Ti:Sapphire multiphoton laser modus-vergrendeld bij 800 nm (> 3 W, 140 fs pulsen, 80 Hz herhaling tarief). De imaging systeem was uitgerust met een standaard electrofysiologie tuig, met inbegrip van een kamer van de perfusie met temperatuurregeling, een vertalen platform met twee micromanipulators, een computergestuurde micro-elektrode-versterker, een digitizer, een stimulatie eenheid, en de software van de overname van de gegevens.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de welzijn van de dieren bescherming Comité van Université Laval en de Canadese Raad op Animal Care. 1. voorafgaande voorbereiding (optioneel: 1 dag van tevoren bereiden) Bereiden drie soorten kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) oplossing (normaal, Sucrose en hersteloplossingen, 1 L elke; Zie tabel 1). De osmolaliteit van de oplossingen voor 300 ± 10 mOsm25 aanpa…

Representative Results

Met behulp van het protocol gepresenteerd hier, verkregen we katten opgeroepen door somatische huidige injectie en door elektrische stimulatie in de dendrites van oriens/alveus interneuronen op de CA1-gebied van de hippocampus. Na het patchen van een neuron, geïdentificeerd op basis van de vorm en positie, verwierven we linescans over een proximale dendriet op meerdere punten gegeven op afstanden van het soma (figuur 1A). We hebben vastgesteld dat een daling…

Discussion

De methode hieronder laat zien hoe de combinatie van de twee-foton Ca^{2 +} beeldvorming en patch-clamp electrofysiologie kan worden gebruikt voor het bestuderen van dendritische Ca^{2 +} signalering in neuronale dendrites in acute hersenen plakjes. Deze methode zorgt voor het toezicht op zowel de lokale Ca^{2 +} verhogingen die door elektrische stimulatie of backpropagating AP in dendritische segmenten, en van de cel somatische reactie opgeroepen. Dit maakt het een uitstekend hulpmiddel om te bes…

Materials

Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems