To-fotonet kalsium Imaging i Neuronal Dendrites i hjernen skiver

Summary

Vi presenterer en metoden forbinder hele celle patch-klemme opptak og to-fotonet imaging å registrere Ca^{2 +} transienter i neuronal dendrites i akutt hjernen skiver.

Abstract

Kalsium (Ca^{2 +}) bildebehandling er et kraftig verktøy for å undersøke spatiotemporal dynamikken i intracellulær Ca^{2 +} signaler i neuronal dendrites. Ca^{2 +} svingninger kan oppstå gjennom en rekke membran og intracellulær mekanismer og spille en avgjørende rolle i induksjon av synaptiske plastisitet og regulering av dendrittiske excitability. Derfor er evnen å fortegnelse typer Ca^{2 +} signaler i dendrittiske grener verdifulle for grupper studere hvordan dendrites integrere informasjon. Bruk av to-fotonet mikroskopi har gjort slike studier betydelig lettere ved å løse problemene bildebehandling i levende vev, som lysspredning og photodamage. Videre gjennom kombinasjon av konvensjonelle elektrofysiologiske teknikker med to-Foton Ca^{2 +} imaging, er det mulig å undersøke lokale Ca^{2 +} svingninger i neuronal dendrites parallelt med opptak av synaptic aktivitet i Soma. Her beskriver vi hvordan du bruker denne metoden til å studere dynamikken i lokale Ca^{2 +} transienter (cat) i dendrites av GABAergic hemmende interneurons. Metoden kan også brukes til å studere dendrittiske Ca^{2 +} signalering i neuronal forskjellige i akutt hjernen skiver.

Introduction

Bidrag av en Nevron nettverk aktivitet avhenger i stor grad av dynamikken i synaptic innganger den mottar. Tradisjonelt avhengig den dominerende metoden for å karakterisere synaptic aktivitet i neurons somatiske hele celle patch-klemme opptak av postsynaptic strøm fremkalt av elektrisk stimulering av axons av passasje. Imidlertid er bare aktivitet av proximally ligger synapser sannferdig rapportert i dette tilfellet¹. I tillegg for å vurdere synapse-spesifikke mekanismene, har innspillinger fra par av neurons og dendrites på et bestemt sted blitt brukt mot synapser rundt og mekanismer for dendrittiske integrasjon, henholdsvis. Et stort gjennombrudd innen synaptic fysiologi ble oppnådd gjennom et ekteskap av optisk og elektrofysiologiske. To-fotonet eksitasjon laserskanning mikroskopi (2PLSM) i kombinasjon med Ca^{2 +} bildebehandling og optogenetic verktøy kan avsløre enorm detaljer om dynamisk organiseringen av synaptic aktivitet på bestemte nevrale forbindelser i hjernen stykker i vitro og i vivo.

Flere viktige fordeler gjort 2PLSM skiller seg ut fra de konvensjonelle, ett-fotonet eksitasjon mikroskopi²: (1) et ikke-lineære naturen av to-fotonet eksitasjon til fluorescens genereres bare i fokal volumet, og alle slippes ut fotoner representerer nyttig signaler (ikke behov for pinhole); (2) lengre bølgelengder, brukes i 2PLSM, trenge spredning vevet mer effektivt; i tillegg er spredte fotoner også fortynne to-fotonet eksitasjon og bakgrunn fluorescens; (3) photodamage og Phototoksisitet er også begrenset til fokalplanet. Derfor til tross for den høye prisen av 2-fotonet systemer med konvensjonelle AC confocal mikroskop fortsatt 2PLSM en metoden for valg for høy oppløsning undersøkelse av neuronal struktur og funksjon i tykke levende vev.

Den første anvendelsen av 2PLSM i spredning vev var å image struktur og funksjon av dendrittiske spines³. 2PLSM i kombinasjon med Ca^{2 +} bildebehandling har avslørt at spines funksjon som isolert biokjemiske avdelinger. Siden i mange neuronal typer det er en en korrespondanse mellom spines og personlige synapser⁴, ble to-Foton Ca^{2 +} imaging snart en nyttig verktøyet rapportering aktiviteten til individuelle synapser i intakt vev^{5, 6,7,8}. Videre ble 2PLSM-baserte Ca^{2 +} imaging brukt til å overvåke enkelt kalsium kanaler og ikke-lineære samspillet mellom de indre og synaptic conductances, samt å vurdere tilstanden – og aktivitet-avhengige regulering av Ca^{2 +} signalering i neuronal dendrites^{5,6,7,8,9,10,11}.

Kalsium er en allestedsnærværende intracellulær andre messenger og sin subcellular spatiotemporal organisasjon bestemmer fysiologiske reaksjoner, fra endringer i synaptiske styrke reguleringen av ion kanaler, dendrite og ryggraden vekst, som celledød og overlevelse. Dendrittiske Ca^{2 +} elevations oppstå via aktivering av flere veier. Handlingen potensialer (APs), backpropagating til dendrites, åpne spenning-gated kalsium kanaler¹² og produsere relativt globale Ca^{2 +} transienter (cat) i dendrites og spines¹³. Synaptiske overføring er forbundet med aktivering av postsynaptic Ca^{2 +}-permeable reseptorer (NMDA, Ca^{2 +}-permeable AMPA og kainate), utløser synaptic kattene^6,14,15. Endelig kan supralinear Ca^{2 +} hendelser genereres i dendrites under visse forhold^11,12,13,16.

To-fotonet Ca^{2 +} imaging i kombinasjon med patch-klemme elektrofysiologiske opptak bruker syntetiske Ca^{2 +}-sensitive fluorescerende indikatorer, som vanligvis leveres gjennom oppdateringen elektroden under hele celle opptak . En standardmetode for kvantifisering av Ca^{2 +} dynamics er basert på dobbelt indikator metoden^17,18. Den bruker to fluorophores med godt adskilt utslipp spectra (f.eks, en kombinasjon av en rød Ca^{2 +}-ufølsom fargestoff med grønne Ca^{2 +} indikatorer, som Oregon Green BAPTA-1 eller Fluo-4) og har flere fordeler sammenlignet med den enkelt indikatoren metode. Først, en Ca^{2 +}-ufølsom fargestoff brukes til å finne små strukturer rundt (dendrittiske grener og spines) der Ca^{2 +} imaging utføres. Det andre beregnes forholdet mellom endringen i grønne og røde fluorescens (ΔG/R) som et mål på [Ca^{2 +}], som er hovedsakelig ufølsom for endringer i planlagt fluorescens på grunn av svingninger i [Ca^{2 +}]₀^{17 , 18}. videre fluorescens endringer kan kalibreres i absolutt Ca^{2 +} konsentrasjoner¹⁹.

En generell bekymring når du kjører to-fotonet Ca^{2 +} tenkelig eksperimenter i akutt skiver er cell helse og stabilitet av bildeopptak fordi at høy laser brukes vanligvis. Ca^{2 +} tenkelig eksperimenter er det også bekymring om forstyrrelsene og betydelig overvurdering av subcellular Ca^{2 +} dynamics skyldes at Ca^{2 +} indikatorer fungere som svært mobile eksogene Ca^{2 +} buffere. Dermed valget av Ca^{2 +} indikatoren og konsentrasjonen avhenger av hvilken neuronal, forventet amplituden av katter, og eksperimentelle spørsmålet.

Vi tilpasset metoden av to-fotonet Ca^{2 +} imaging for undersøkelse av Ca^{2 +} svingninger i dendrites GABAergic interneurons^{9,10,11,20,21 , 22}. mens mesteparten av Ca^{2 +} imaging studier ble gjort i viktigste nerveceller, hemmende interneurons presentere en rekke funksjonelle Ca^{2 +} mekanismer som er forskjellige fra de i pyramideformet celler^{20 , 23 , 24}. disse interneuron-spesifikke mekanismene (f.eks, Ca^{2 +} permeable AMPA reseptorer) kan spille spesifikke roller i å regulere celle aktivitet. Mens dendrittiske Ca^{2 +} signalering i interneurons er en fristende mål for videre etterforskning, presenterer to-Foton Ca^{2 +} bildebehandling i dendrites av disse cellene flere utfordringer, fra tynnere diameter dendrites og mangel på spines til spesielt endogene Ca^{2 +} bindende bæreevne. Som vår forskningsinteresser fokus på studiet av hippocampus interneurons, var følgende protokollen, mens gjelder for ulike neuronal befolkningsgrupper, tilpasset å håndtere disse utfordringene.

Denne protokollen ble utført med en kommersiell AC confocal to-fotonet mikroskop, som var utstyrt med to eksterne, ikke-descanned detektorer (NDDs), elektro-optiske modulator (EOM) og en Dodt skanning gradient kontrast (SGC), og installert på en optisk tabell. Mikroskopet ble kombinert med en Ti:Sapphire multiphoton laser modus-låst på 800 nm (> 3 W, 140 fs pulser, 80 Hz gjentakelseshastigheten). Bildebehandling systemet var utstyrt med en standard elektrofysiologi rigg, inkludert en perfusjonsmåling kammer med temperaturkontroll, en oversette plattform med to micromanipulators, en datastyrt microelectrode forsterker, en digitaliseringsenhet, en stimulering enheten, og programvare for oppkjøpet.

Protocol

Alle eksperimentene ble utført i henhold til dyrevelferd veiledning av dyr beskyttelse komiteen av Université Laval og kanadiske Rådet for Animal Care. 1. foreløpige forberedelse (valgfritt: forberede 1 dag i forveien) Forberede tre typer kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) løsning (Normal, sukrose og gjenopprettingsløsninger, 1 L hver, se tabell 1). Justere osmolality av løsninger til 300 ± 10 mOsm25 og kul ACSF-sukrose ned nær frysep…

Representative Results

Ved hjelp av protokollen som presenteres her, fikk vi kattene fremkalt av somatiske aktuell sprøytebruk og elektrisk stimulering i dendrites av oriens/alveus interneurons innen CA1 hippocampus. Etter patching en Nevron, identifiseres basert på dens form og stilling, vi kjøpte linescans over en proksimale dendrite på flere punkter på gitt avstander fra soma (figur 1A). Observerte vi en nedgang i amplituden til katter indusert av backpropagating APs som av…

Discussion

Metoden vist her demonstrerer hvordan kombinasjonen av to-fotonet Ca^{2 +} bildebehandling og patch-klemme elektrofysiologi kan brukes for å studere dendrittiske Ca^{2 +} signalering i neuronal dendrites i akutt hjernen skiver. Denne metoden tillater overvåking av både den lokale Ca^{2 +} høyder fremkalt av elektrisk stimulering eller backpropagating AP dendrittiske segmenter og celle somatiske respons. Dette gjør det et utmerket verktøy for å studere hvordan ulike deler av dendrittiske tre…

Materials

Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems