Dissektion och färgning av Drosophila Pupp äggstockarna
Summary
Drosophila äggstocken är en utmärkt modell för att studera stamceller nisch utveckling. Även om metoder för dissekera larver och vuxna äggstockarna har publicerats, kräver Pupp äggstock dissektioner olika tekniker som inte har publicerats i detalj. Här beskriver vi ett protokoll för dissekera, färgning och montering Pupp äggstockarna.
Abstract
Till skillnad från vuxna Drosophila äggstockar, Pupp äggstockar är relativt svårt att komma åt och undersöka på grund av deras små storlek, genomskinlighet och innesluta inom en Pupp fall. Utmaningen att dissekera Pupp äggstockarna ligger också i deras fysiska plats inom puppan: äggstockarna är omgivna av fett kroppsceller inne i Pupp buken, och dessa fettceller måste avlägsnas för att möjliggöra korrekt antikropp färgning. Detta protokoll använder för att övervinna dessa utmaningar, och tredjeparts anpassade Pasteur-pipetter för att extrahera fett kroppsceller från Pupp buken. Dessutom används ett kamrar täckglas istället för en mikrocentrifug rör under färgning processen för att förbättra synligheten för puppor. Men trots dessa och andra fördelar med de verktyg som används i detta protokoll, kan framgångsrikt genomförande av dessa tekniker fortfarande innebära flera dagars praktik på grund av den lilla storleken på Pupp äggstockarna. De tekniker som beskrivs i detta protokoll skulle kunna tillämpas på tid kursen experiment där äggstockarna analyseras i olika skeden av Pupp utveckling.
Introduction
Stamcellsforskning använda Drosophila äggstockarna har kraftigt expanderat sedan den första dokumentationen av en stamcell nisch1,2,3,4. Följer utvecklingen av lineage tracing genetiska verktyg, Drosophila äggstock dissektioner har ofta använts för att studera stamceller härstamningar och signalering vägar som reglerar stamceller underhåll, spridning och öde i stamcellsnischen. Kunskap om dessa signalvägar kan ge insikter om potentiella orsaker till cancer som härrör från aberrant stem cell aktivitet5,6,7. Det har nyligen också visat att somatiska stamceller i Drosophila äggstocken, kallas follikel stamceller (Scheme), starkt liknar däggdjur intestinal stamceller i många aspekter av deras organisation8. Av denna anledning är Drosophila äggstockar mycket användbara modellsystem för att studera stamceller beteende.
Även larver och vuxna äggstockarna erbjuda ledtrådar till tidig stamceller utveckling och slutliga stamceller organisation i nisch, respektive, är Pupp äggstocken en mellanliggande struktur där de könsceller och kroppsceller omorganisera och fastställa deras identiteter 9 , 10. om flera studier har undersökt aspekter av vävnad utveckling i Pupp äggstock10,11,12,13, frågor kvarstår om differentiering och rumslig organisation ovariell celltyper under Pupp utveckling. I synnerhet uppstår specifikationen av Scheme under denna period. Detta protokoll beskriver en metod för dissekera och färgning Pupp äggstockarna vid önskade tidpunkter – en teknik som kan användas i tid kursen experiment som analysera Pupp äggstock utveckling i detalj från den larver till vuxen scenen.
För att beakta den liten storlek, genomskinlighet och otillgänglighet Pupp äggstockscancer i Pupp buken, detta protokoll använder verktyg såsom en skräddarsydd tunn spets Pasteur Pipettera ta bort buk fett vävnad hindrar antikropp tillgång till den äggstockarna. En klar, kamrar täckglas används under antikroppen färgning erbjuder större synlighet puppor och en skonsammare plattform för gunga äggstockarna på en ”Nutator”. Baserad på ett protokoll för larval äggstock dissektioner av Maimon och Gilboa14, en relativt hög koncentration av Triton x-100 har varit anställd i de inledande stegen i färgningsproceduren att maximera cellmembranet permeabilisering och antikropp tillgång till den äggstockscancer celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest kritiska och svåra steget i detta protokoll innebär utarbetandet av Pupp äggstockarna före fixering. För att säkerställa att äggstockarna, små och begraven av fett kroppsceller inuti Pupp buken, färgas tillräckligt med antikroppar, är det viktigt att inte bara Riva en stor öppning i buken säcken med pincett, men också extrahera fett kroppens celler som hindrar den äggstockarna från antikropparna. Framgångsrikt genomförande av detta steg kräver tillämpning av subtila tryck på Pasteur Pipette…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av National Institutes of Health (RO1 GM079351 till D.K.). Vi tackar Dorothea Godt för hennes goda råd om Pupp äggstock dissektioner baserat på hennes ursprungliga protokollet. Vi tackar också Amy Reilein för hennes hjälp och synpunkter på manuskriptet.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
