Drosophila eggstokken er en utmerket modell for studerer stamcelleforskningen nisjeinteresser utvikling. Selv om metoder for dissekere larver og voksne eggstokkene har blitt publisert, krever pupal eggstokk disseksjoner forskjellige teknikker som ikke er publisert i detalj. Her skissere vi en protokoll for dissekere flekker og montering pupal eggstokkene.
I motsetning til voksen Drosophila eggstokkene, pupal eggstokkene er relativt vanskelige tilgang og undersøke på grunn av sin lille størrelse, translucence og encasing innenfor en pupal sak. Utfordringen med å dissekere pupal eggstokkene ligger også i deres fysiske plassering i puppe: eggstokkene er omgitt av fett kroppens celler inne pupal magen, og disse fett celler må fjernes for å gi riktig antistoff flekker. For å overvinne disse utfordringene, benytter denne protokollen tilpasset Pasteur Pipetter for flergangsbruk for å trekke ut fett kroppens celler fra pupal magen. Videre brukes en kamret coverglass i stedet for et microcentrifuge rør under farging prosessen for å forbedre synligheten av pupae. Men til tross for disse og andre fordeler av verktøyene som brukes i denne protokollen, kan vellykket gjennomføring av disse teknikkene fortsatt innebære flere dager praksis på grunn av den lille størrelsen på pupal eggstokkene. Teknikkene i denne protokollen kan brukes til tid kurs eksperimenter som analyseres eggstokkene på ulike stadier av pupal utvikling.
Stilk cellen forskning benytter Drosophila eggstokkene vokst mye siden den første dokumentasjonen av en stilk cellen nisje1,2,3,4. Følge utviklingen av avstamning genetisk sporingsverktøyene, Drosophila eggstokk disseksjoner har blitt brukt til å studere stamcelleforskningen overleveringslinjer og signalnettverk trasé som regulerer stamcelleforskningen vedlikehold, spredning og skjebne i stamcelleforskningen nisje. Kunnskap om disse signalveier kan gi innsikt i mulige årsaker til kreft fra avvikende stamcelleforskningen aktivitet5,6,7. Det har også nylig vist at somatiske stamceller i Drosophila eggstokken, kjent som hårsekken stamceller (FSCs), sterkt ligner pattedyr intestinal stamceller i mange aspekter av deres organisasjon8. Derfor er Drosophila eggstokkene et svært nyttig modellsystem for å studere stamcelleforskningen atferd.
Larver og voksne eggstokkene tilbyr ledetråder til tidlig stamcelleforskningen utvikling og siste stamceller organisasjon i nisje, henholdsvis, er pupal eggstokken en midlertidig struktur som germline og somatiske celler omorganisere og etablere sin identitet 9 , 10. flere studier har undersøkt aspekter av vev utvikling i pupal eggstokk10,11,12,13, forblir spørsmål om differensiering og romlig organisering ovarian celletyper under pupal utvikling. Spesielt oppstår spesifisering av FSCs i denne perioden. Denne protokollen definerer en metode for dissekere og flekker pupal eggstokkene på ønsket tidspunkt-en teknikk som kan brukes i gang kurs eksperimenter som analyserer pupal eggstokk utvikling i detalj fra den larver det voksne stadiet.
Kontoen for liten størrelse, translucence og veddemålsplasseringer av pupal eggstokken innen pupal magen, denne protokollen bruker verktøy som en skreddersydd tynn-tipped Pasteur Pipetter fjerne abdominal fett kroppens vev hindrer antistoff tilgang til den eggstokkene. En klar og kamret coverglass brukes under antistoffer flekker tilbyr synlighet av pupae og en mildere plattform for rocking eggstokkene på en “Nutator.” Basert på en protokoll for disseksjoner larver eggstokken av Maimon og Gilboa14, en relativt høy konsentrasjon av Triton X-100 har vært ansatt i de første trinnene av flekker prosedyren å maksimere cellemembranen permeabilization og antistoff tilgang til den ovarian celler.
Det mest viktige og vanskelige trinnet av denne protokollen innebærer utarbeidelsen av pupal eggstokkene før fiksering. For å sikre at eggstokkene, små og begravd fett kroppens celler inne pupal magen, er farget tilstrekkelig med antistoffer, er det viktig å ikke bare rive en stor åpning i abdominal sekk med tang, men også trekke ut fett kroppens celler som hindrer den eggstokkene fra antistoffer. Vellykket gjennomføring av dette trinnet krever anvendelse av subtile press på Pasteur Pipetter pære mens du vasker…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health (RO1 GM079351 til dk). Vi takker Dorothea Godt for hennes nyttige råd på pupal eggstokk disseksjoner basert på hennes opprinnelige protokollen. Vi takker også Amy Reilein for hennes assistanse og kommentarer på manuskriptet.
Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
Bunsen burner | Various vendors | ||
Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Double-sided tape | Scotch | ||
Nutator | Clay Adams | ||
Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |