Påvisningen og kvantificeringen af Plasmodium falciparum i vandig røde blodlegemer af svækket samlede refleksion infrarødspektroskopi og multivariat dataanalyse
Summary
Vi præsenterer her, en protokol til påvisning og kvantificering af Plasmodium falciparum i inficerede vandig røde blodlegemer ved hjælp af en svækket samlede refleksion infrarøde spektrometer og multivariat dataanalyse.
Abstract
Vi demonstrere en metode til kvantificering og påvisning af parasitter i vandig røde blodlegemer (RBC) ved hjælp af en simpel benchtop svækket samlede refleksion Fourier Transform infrarød (ATR-FTIR) spektrometer sammenholdt med multivariat dataanalyse ( MVDA). 3D 7 P. falciparum blev kultiveret til 10% parasitemia ring fase parasitter og bruges til spike frisk donor isoleret røde blodlegemer for at oprette en fortynding serien mellem 0 – 1%. 10 µL af hver prøve blev placeret på midten af vinduet ATR diamant til at erhverve spektret. Eksempeldata blev behandlet til at forbedre signal-støj-forholdet og fjerne bidrag af vand, og derefter den anden afledede blev anvendt til at løse spektrale egenskaber. Dataene blev derefter analyseret ved hjælp af to typer af MVDA: første Principal komponent analyse (PCA) til at afgøre enhver afvigende og derefter delvis mindste kvadraters Regression (PLS-R) til at bygge modellen kvantificering.
Introduction
Malaria er blandt de mest ødelæggende sygdomme i vor tid; over halvdelen af befolkningen lever i fare i endemiske områder og det tynger uforholdsmæssigt fattige1,2,3,4. En stor del af problemet er asymptomatiske bærere og tidlige fase patienter der fungere som reservoirer for myg vektorer5, forårsager pigge af infektion i våde årstider og gør det muligt at persistere i Fællesskaber. Malaria forårsages af fem Plasmodium parasitter, den mest dødbringende som er P. falciparum , som forårsager den mest alvorlige form af sygdommen2.
Teknikker til diagnosticering af malaria er i øjeblikket mindre end perfekt. Optisk mikroskopi, den nuværende guld standard, kan kun registrere 62-88 parasitter/µL afhængigt af den anvendte metode6. Desuden, på grund af vækstens og høje kvalifikationer kræves, i mange regioner mikroskopi misdiagnoses > 50% af tilfældene, især dem med lavt parasitaemia niveauer2, der direkte kan henføres til manglen ressourcer i området og resultater i misbrug af malariamedicin. De andre 2 vigtigste diagnostiske metoder er hurtige diagnostiske test (RDTs), der anvender antistoffer til påvisning og Polymerase Chain Reaction (PCR) assays, der diskriminerer og kvantificere parasitter fra DNA. I øjeblikket, er RDTs kun i stand til at opdage P. falciparum og P. vivax af mindst 100 parasitter/µL af blod medførende sjældnere former af sygdommen er ubehandlet. 7 , 8 derimod PCR assays diskriminerer og kvantificere forskellige arter af Plasmodium på en følsomhed på 0,0004-5 parasitter/µL af blod. Men det kræver dyre reagenser, udstyr og tekniske færdigheder, og er således ikke egnet til programmet felt.
En meget følsom, pålidelig og overkommelig teknik er afgørende at forbedre diagnose gange, og dermed forbedre patienternes resultater, og gør sygdommen eliminering muligt. Svækket samlede refleksion Fourier transform (ATR-FTIR) spektroskopi tilbyder en mulig løsning på dette problem. Tidligere arbejde har vist, at det var muligt at detektere og kvantificere P. falciparum i methanol fast blod film opnå påvisningsgrænserne for < 1 parasit/µL af blod (< 0.0002% parasitemia)9, som er sammenlignelig med PCR metoder. Nylige undersøgelser har vist, at det er muligt at detektere og kvantificere parasitter i vandige prøver og dermed fjerne trinnet fiksering. Faktorer som vanddamp, spektrale støj og data behandling skal dog tages i betragtning for optimale resultater10.
Denne protokol har til formål at vise nye brugere hvordan til at erhverve ATR-FTIR spectra og forberede en regressionsmodel til påvisning af P. falciparum fra vandige røde blodlegemer (RBC) prøver10.
Protocol
Representative Results
Discussion
PLS-R-model er en overvåget multivariat metode, der finder en lineær sammenhæng, Y = bX + E, mellem de prædiktive variabler X (her, absorbans ved hver wavenumber) og en kontinuerlig variabel Y (her, parasitemia niveauet). Kort sagt, modellen kombinerer variabler i X til at oprette et nyt sæt af latent variabler (LVs) at fange afvigelse på X korreleret med Y, og beregner en regression vektor (b) der ganges med en ny spektrum resultater i forbindelse med vurdering af y-værdi. Styrken af modellen kan tages fra to væ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering af forfatterne blev leveret af det australske Forskningsråd (fremtid Fellowship FT120100926 til BRW), National sundhed og medicinsk forskning Rådet for Australien (Program grant og Senior Research Fellowship at BENTS; Tidlig karriere stipendier JSR; Infrastruktur for forskning institutter støtte ordningen tilskud til Burnet Institute), og den victorianske stats regering operationelle infrastruktur støtte Grant Burnet Institute. Vi anerkender Mr. Finlay Shanks for instrumental støtte.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
