पता लगाना और प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के जलीय लाल रक्त कोशिकाओं में ठहराव तनु कुल प्रतिबिंब अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी और बहुभिंनरूपी डेटा विश्लेषण द्वारा
Summary
यहां, हम पता लगाने और संक्रमित जलीय लाल रक्त कोशिकाओं में प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम के ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक तनु कुल प्रतिबिंब अवरक्त स्पेक्ट्रोमीटर और बहुभिंनरूपी डेटा विश्लेषण का उपयोग कर ।
Abstract
हम ठहराव का एक तरीका है और जलीय लाल रक्त कोशिकाओं में परजीवी का पता लगाने का प्रदर्शन (RBCs) एक सरल benchtop का उपयोग करके तनु कुल परावर्तन रूपान्तर स्पेक्ट्रोमीटर डेटा विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में अवरक्त (एटीआर-स्विचेज) बहुभिंनरूपी रूपांतरण ( MVDA) । 3D7 P. फाल्सीपेरम 10% parasitemia अंगूठी चरण परजीवी को प्रसंस्कृत थे और ताजा दाता अलग RBCs के बीच एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला बनाने के लिए 0-1% कील थे । 10 प्रत्येक नमूने के µ एल एटीआर हीरे की खिड़की के केंद्र पर रखा स्पेक्ट्रम प्राप्त किया गया । नमूना डेटा शोर अनुपात करने के लिए संकेत में सुधार करने के लिए और पानी के योगदान को दूर करने के लिए इलाज किया गया था, और फिर दूसरी व्युत्पंन वर्णक्रमीय सुविधाओं को हल करने के लिए लागू किया गया था । डेटा तो MVDA के दो प्रकार: पहले मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग कर किसी भी outliers निर्धारित करने के लिए और फिर आंशिक कम वर्गों प्रतिगमन (PLS-R) ठहराव मॉडल बनाने के लिए विश्लेषण किया गया ।
Introduction
मलेरिया हमारे समय के सबसे विनाशकारी रोगों के बीच है; आधी से अधिक आबादी स्थानिकमारी वाले क्षेत्रों में जोखिम में रहती है और यह अधिकतर बोझ गरीब1,2,3,4। इस मुद्दे का एक बड़ा हिस्सा स्पर्शोन्मुख वाहक और प्रारंभिक चरण के रोगियों है कि मच्छर वैक्टर5के लिए जलाशयों के रूप में कार्य, गीला मौसम के दौरान संक्रमण के spikes के कारण और यह समुदायों में जारी रखने के लिए अनुमति देता है । मलेरिया पाँच प्लाज्मोडियम परजीवी के कारण होता है, जिनमें से सर्वाधिक घातक पी. फाल्सीपेरम है जो रोग के सबसे गंभीर रूप2का कारण बनता है.
वर्तमान में, मलेरिया के निदान के लिए तकनीक सही से कम कर रहे हैं । ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी, वर्तमान सोने के मानक, केवल 62-88 परजीवी का पता लगा सकते है/µ एल विधि के आधार पर6का इस्तेमाल किया । इसके अलावा, गहन और उच्च कौशल की आवश्यकता के कारण, कई क्षेत्रों में सूक्ष्म निदान > 50% मामलों के, विशेष रूप से कम parasitaemia2स्तर है, जो सीधे क्षेत्र और परिणामों में संसाधनों की कमी के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है के साथ उन में विरोधी मलेरिया दवाओं का दुरुपयोग । अंय 2 मुख्य नैदानिक तरीकों रैपिड नैदानिक परीक्षण (RDTs), जो पता लगाने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं, और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) परख, जो भेदभाव और डीएनए से परजीवी मात्रा । वर्तमान में, RDTs ही कर रहे है पी फाल्सीपेरम और पी vivax का पता लगाने के कम १०० परजीवी/µ एल के रक्त रोग के दुर्लभ रूपों में जिसके परिणामस्वरूप इलाज किया जा रहा है । 7 , 8 इसके विपरीत, पीसीआर परख भेदभाव और 0.0004 की एक संवेदनशीलता-5 परजीवी/µ एल रक्त में प्लाज्मोडियम की विभिंन प्रजातियों को बढ़ाता है । हालांकि, यह महंगा रिएजेंट, उपकरण और तकनीकी कौशल की आवश्यकता है, और इस प्रकार क्षेत्र आवेदन के लिए उपयुक्त नहीं है ।
एक अति संवेदनशील, विश्वसनीय और सस्ती तकनीक निदान समय में सुधार करने के लिए आवश्यक है, और इस प्रकार रोगी परिणामों में सुधार, और रोग उन्मूलन संभव बनाने. तनु कुल प्रतिबिंब रूपान्तर रूपांतर (एटीआर-स्विचेज) स्पेक्ट्रोस्कोपी इस समस्या का एक संभावित समाधान प्रदान करता है । पिछले काम से पता चला है कि यह संभव था पता लगाने के लिए और मेथनॉल में P. फाल्सीपेरम मात्रा तय रक्त फिल्मों < 1 परजीवी/µ एल रक्त (< 0.0002% parasitemia)9, जो पीसीआर तरीकों के बराबर है की पहचान की सीमा को प्राप्त करने । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि यह पता लगाने और जलीय नमूनों में परजीवी मात्रा और इस तरह निर्धारण कदम को खत्म करने के लिए संभव है । हालांकि, जल वाष्प, वर्णक्रमीय शोर और डेटा उपचार के रूप में कारकों इष्टतम परिणाम10के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए ।
इस प्रोटोकॉल के लिए नए उपयोगकर्ताओं को कैसे एटीआर-स्विचेज स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए और फाल्सीपेरम का पता लगाने के लिए एक प्रतिगमन मॉडल तैयार जलीय लाल रक्त कोशिकाओं से (आरबीसी)10नमूनों को दिखाने के लिए करना है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
PLS-R मॉडल एक निगरानी बहुभिंनरूपी विधि है कि एक रैखिक संबंध पाता है, y = bX + ई, के बीच पूर्वानुमान चर X (यहां, प्रत्येक wavenumber पर अवशोषक) और एक सतत चर y (यहां, parasitemia स्तर) । संक्षेप में, मॉडल एक्स में चर को जोड़ती है अव्यक्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को वित्त पोषण ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (फ्यूचर फैलोशिप FT120100926 to BRW), ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (प्रोग्राम अनुदान और JGB को वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप द्वारा प्रदान किया गया था; अर्ली करियर फैलोशिप JSR; अनुसंधान संस्थानों के लिए बुनियादी ढांचा सहायता योजना Burnet संस्थान को अनुदान), और विक्टोरियन राज्य सरकार Burnet संस्थान को बुनियादी ढांचा सहायता अनुदान । हम वाद्य समर्थन के लिए श्री फिनले टांगें स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
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