Gjenkjennings- og kvantifisering av Plasmodium falciparum i vandig røde blodceller av dempes totale refleksjon infrarødspektroskopi og multivariabel analyse
Summary
Her presenterer vi en protokoll av kvantifisering av Plasmodium falciparum i infiserte vandig røde blodlegemer bruke dempes totale refleksjon infrarød spectrometer og multivariat dataanalyse.
Abstract
Vi viser en metode for kvantifisering og påvisning av parasitter i vandig røde blodlegemer (RBCs) ved hjelp av en enkel Borstemmaskin dempes totale refleksjon Fourier transformere infrarød (ATR-FTIR) spectrometer sammen med multivariabel analyse ( MVDA). 3D 7 P. falciparum ble kultivert for 10% parasitemia ring scenen parasitter og brukes å pigge frisk donor isolert RBCs for å opprette en fortynning mellom 0-1%. 10 µL av hvert utvalg plassert på midten av vinduet ATR diamant å erverve spekteret. Eksempeldataene ble behandlet til å forbedre signal til støyforhold og fjerne bidrag av vann, og deretter den andre deriverte ble brukt til å løse spectral funksjoner. Dataene ble deretter analysert ved hjelp av to typer MVDA: første viktigste komponenten analyse (PCA) til å fastslå eventuelle outliers og deretter delvis minste kvadrater regresjon (PLS-R) å bygge kvantifisering modell.
Introduction
Malaria er blant de mest ødeleggende sykdommene i vår tid; over halvparten av befolkningen lever i faresonen i endemiske områder og det byrder uforholdsmessig dårlig1,2,3,4. En stor del av problemet er asymptomatisk bærere og tidlig stadium pasienter som reservoarer for mygg vektorer5, forårsaker pigger av infeksjon i våte sesonger og tillater den å vedvare i fellesskap. Malaria skyldes fem Plasmodium parasitter, den mest dødelige som er P. falciparum som forårsaker den strengeste formen av sykdom2.
Foreløpig er teknikker for diagnostisering av malaria mindre enn perfekt. Optisk mikroskopi, gjeldende gull standard, kan bare oppdage 62-88 parasitter/µL avhengig av oppfølgingsmetoden6. Videre, på grunn av sier og høye ferdigheter som kreves, i mange regioner mikroskopi misdiagnoses > 50% av tilfellene, spesielt de med lav parasitaemia nivå2, som kan direkte tilskrives mangel på ressurser i området og resultater i misbruk av anti-malarial medikamenter. De andre 2 viktigste diagnostiske metodene er rask diagnostiseringstester (RDTs), som utnytter antistoffer for deteksjon og Polymerase kjedereaksjon (PCR) analyser, som diskriminerer og kvantifisere parasitter fra DNA. Foreløpig er RDTs bare kjøpedyktig merker P. falciparum og P. Samsung av minst 100 parasitter/µL av blod som resulterer i sjeldne former av sykdommen som ubehandlet. 7 , 8 i kontrast, PCR analyser diskriminere og kvantifisere ulike arter av Plasmodium på en følsomhet på 0,0004-5 parasitter/µL av blod. Men det krever dyre reagenser, utstyr og tekniske ferdigheter, og dermed er ikke egnet for programmet feltet.
En svært følsom, pålitelig og rimelig teknikk er viktig å bedre diagnose ganger, og dermed bedre pasientens utfall og gjør sykdommen eliminering mulig. Dempes totale refleksjon Fourier transform (ATR-FTIR) spektroskopi tilbyr en mulig løsning på dette problemet. Tidligere arbeid har vist at det var mulig å oppdage og kvantifisere P. falciparum i metanol fast blod filmer å oppnå oppdagelsen grensene for < 1 parasitten/µL av blod (< 0.0002% parasitemia)9, som er sammenlignbare med PCR metoder. Nyere studier har vist at det er mulig å oppdage og kvantifisere parasitter i vandig prøver og dermed eliminerer fiksering trinnet. Faktorer som vanndamp, spectral støy og data behandling må imidlertid tas i betraktning for optimale resultater10.
Denne protokollen skal vise nye brukere hvordan du anskaffer ATR-FTIR spectra og forberede en regresjonsmodell for påvisning av P. falciparum vandig røde blodlegemer (RBC) prøver10.
Protocol
Representative Results
Discussion
PLS-R-modellen er en veiledet multivariabel metode som finner en lineær sammenheng, Y = bX + E, mellom prediktiv variablene X (her, absorbans ved hver wavenumber) og en kontinuerlig variabel Y (her, hvilket parasitemia). Kort sagt, modellen kombinerer variablene i X for å opprette et nytt sett av latent variabler (LVs) som fange variansen på X korrelert med Y, og beregner en regresjon vektor (b) som ganges med en ny spektrum resulterer i estimering av y-verdien. Styrken på modellen kan bli tatt fra to verdier: R…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Midler til forfatterne ble gitt av den australske forskningsråd (fremtiden fellesskap FT120100926 til BRW), National Health og medisinsk forskning rådet i Australia (programmet grant og Senior Research Fellowship til JGB; Tidlig karriere stipend JSR; Infrastruktur for forskning institutter støtte ordningen Grant til Burnet Institute), og den viktorianske stat regjeringen operative infrastrukturen støtte Grant til Burnet Institute. Vi erkjenner Mr. Finlay Shanks instrumental støtte.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
