Identifiering och kvantifiering av Plasmodiumfalciparum i vattenlösning röda blodkroppar av försvagade Total reflektion infraröd spektroskopi och multivariat dataanalys
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för påvisande och kvantifiering av Plasmodiumfalciparum i infekterade aqueous röda blodkroppar med hjälp av ett försvagat total reflektion IR spektrometer och multivariat dataanalys.
Abstract
Vi visar en metod för kvantifiering och upptäckt av parasiter i vattenlösning röda blodkroppar (RBC) med hjälp av en enkel bänkmonterade försvagade Total reflektion Fourier Transform infraröd (ATR-FTIR) spektrometer tillsammans med multivariat dataanalys ( MVDA). 3D 7 P. falciparum odlade till 10% parasitemia ringen scenen parasiter och användes att spika frisk donator isolerade röda blodkropparna för att skapa en utspädning serie mellan 0 – 1%. 10 µL av varje prov placerades på mitten av fönstret ATR diamond att förvärva spektrumet. Exempeldata behandlades att förbättra signal-brusförhållande och ta bort bidraget av vatten, och sedan andraderivatan tillämpades lös spektrala funktioner. Data analyserades sedan med hjälp av två typer av MVDA: första Principal komponent analys (PCA) att fastställa eventuella extremvärden och sedan delvis minstakvadratmetoden Regression (PLS-R) att bygga en kvantifiering modell.
Introduction
Malaria är bland de mest förödande sjukdomarna i vår tid; över hälften av befolkningen lever i riskzonen i endemiska områden och det bördor oproportionerligt dåliga1,2,3,4. En stor del av problemet är asymtomatiska bärare och tidiga skede patienter som fungerar som reservoarer för mygga vektorer5, orsaka spikar av infektion under våta säsonger och gör det möjligt att kvarstå i samhällen. Malaria orsakas av fem Plasmodium parasiter, den mest dödliga som är P. falciparum som orsakar den svåraste formen av sjukdomen2.
Tekniker för diagnos av malaria närvarande mindre än perfekt. Optisk mikroskopi, nuvarande guldmyntfoten, kan endast upptäcka 62-88 parasiter/µL beroende på metod som används för6. Dessutom tack vare riskkällan och hög kompetens krävs, i många regioner mikroskopi feldiagnoser > 50% av fallen, särskilt de med låga parasitaemia nivåer2, som direkt kan hänföras till bristen på resurser i området och resultaten i missbruk av läkemedel mot malaria. De andra 2 viktigaste diagnostiska metoderna är snabba diagnostiska tester (RDTs), som använder antikroppar för påvisande och Polymerase Chain Reaction (PCR)-analyser, som diskriminerar och kvantifiera parasiter från DNA. RDTs för närvarande endast kunna upptäcka P. falciparum och P. vivax av minst 100 parasiter/µL blod vilket resulterar i ovanligare former av sjukdomen är obehandlade. 7 , 8 däremot PCR assays diskriminera och kvantifiera olika arter av Plasmodium på en känslighet på 0,0004-5 parasiter/µL blod. Dock kräver dyra reagenser, utrustning och tekniska skicklighet, och därmed är inte lämplig för programmet fältet.
En mycket känslig, pålitlig och prisvärd teknik är nödvändigt att förbättra diagnos gånger, och därmed förbättra behandlingsresultaten och gör sjukdomen avskaffande möjligt. Försvagade Total reflektion Fourier transform (ATR-FTIR) spektroskopi erbjuder en möjlig lösning på problemet. Tidigare arbete har visat att det var möjligt att upptäcka och kvantifiera P. falciparum i metanol fast blod filmer att nå detektionsgränser < 1 parasit/µL blod (< 0,0002% parasitemia)9, som är jämförbar med PCR-metoder. Nyligen genomförda studier har visat att det är möjligt att upptäcka och kvantifiera parasiter i vattenlösning prover och därmed eliminera det fixering steget. Faktorer såsom vattenånga, spektrala buller och data behandling måste dock beaktas för optimalt resultat10.
Detta protokoll syftar till hur nya användare kan förvärva ATR-FTIR spectra och förbereda en regressionsmodell för detektion av P. falciparum från aqueous röda blodkroppar (RBC) prover10.
Protocol
Representative Results
Discussion
PLS-R-modellen är en övervakad multivariat metod som finner en linjär relation, Y = bX + E, mellan de prediktiva variablerna X (här, absorbansen vid varje Vågtal) och en kontinuerlig variabel Y (här, parasitemia nivån). Kort sagt, modellen kombinerar variabler i X för att skapa en ny uppsättning av latenta variabler (LVs) som fångar variansen på X korrelerade med Y, och beräknar en regression vektor (b) som multipliceras med en nya spektrum resultat vid uppskattning av y-värde. Styrkan i modellen kan tas fr?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering till författarna tillhandahölls av det australiska forskningsrådet (framtiden gemenskap FT120100926 till BRW), nationella hälso- och medicinsk forskning rådet i Australien (Program grant och Senior Research Fellowship till Anja; Tidig karriär stipendier JSR; Infrastruktur för forskning institut Support system bidrag till Burnet Institute), och den viktorianska statliga regeringen operativa infrastrukturen stöder bidrag till Burnet Institute. Vi erkänner Mr Finlay Shanks för instrumental stöd.
Materials
| Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
| Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
| 3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
| RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
| Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
| Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
| Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
| 50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
| 10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
| Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
| Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
| Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
| Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
| Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
| Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
| Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
| The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
| PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |
References
- Hommel, M., Gilles, H., Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Chapter 20. Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. , 361 (1998).
- World Health Organization. . World Malaria Report 2016. , (2016).
- Rogers, W., Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. , 1355 (1999).
- White, N. J. Chapter 9. Manson’s Tropical Infectious Diseases. 23, 532-600 (2014).
- Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11 (6), 623-639 (2013).
- Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18 (9), 395-398 (2002).
- Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13 (1), 234-241 (2014).
- World Health Organisation. . Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). , (2014).
- Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
- Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142 (8), 1192-1199 (2017).
- Fabian, H., Mäntele, W. . Handbook of Vibrational Spectroscopy. , (2006).
- Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39 (13), 5439-5448 (2011).
- Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
- Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48 (4), (1952).
