כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעה של פפטידים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט. שיטה זו מאפשרת הקניית מהיר ולא מאוד לשחזור נתונים כמותיים על מהירות הסגר ההעברה וגמר התא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מטרת עבודה זו היא להציג שיטה להעריך את היכולת של מולקולות immunomodulatory, כגון מיקרוביאלית פפטידים (אמפר), כדי לעורר את נדידת תאים. חשוב לציין, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב במהלך תהליך ריפוי פצע לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה. היתרון של שיטה זו על וזמינותו הקלאסית, אשר מבוסס על שריטה עשה באופן ידני בטפט התא, הוא שהשימוש של תרבות סיליקון מיוחד מוסיף מתן שני תאים כדי ליצור שדה מדומים הפצע נטול תאים עם רוחב מוגדרים היטב (500 μm ). בנוסף, עקב פלטפורמה ניתוח התמונה האוטומטי, אפשרי להשיג במהירות נתונים כמותיים על מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. ליתר דיוק, ההשפעה של שני אמפר עור הצפרדע על ההעברה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט יוצגו. יתר על כן, רעלני של תאים אלה עם מעכבי ספציפית יספק מידע על המנגנונים המולקולריים שבבסיס אירועים כאלה.
מבוא
היא ידועה בעיקר כי ריפוי הפצע בבעלי חיים הוא תהליך מהותי לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה1. למרות אפיתל משטחים חשופים לסביבה החיצונית (למשל, העור, מערכת הנשימה, ו נרחבים במערכת העיכול) ליצור מחסום מגן מפני עלבונות פיזיקליות, כימיות, היווצרות הפצעים יכול בקלות להתרחש, במיוחד אחרי ניתוח או זיהומים חיידקים2. לדוגמה, קולוניזציה של רקמת הריאה על ידי פתוגן חיידקי הזדמנותית Pseudomonas aeruginosa, במיוחד אצל חולי סיסטיק פיברוזיס (CF), מוביל לפגיעה של האפיתל איירווייז עם כשל נשימתי הסוגר3, 4. ריפוי הפצע הוא מנגנון תיקון מאר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תא הכנה
- זרע 2.5x106 תאים 10 מ"ל של מינימום הכרחי בינוני (מאמ) בתוספת 2 מ מ גלוטמין (MEMg), בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), אנטיביוטיקה (0.1 מ"ג/מ"ל של פניצילין, סטרפטומיצין) ו puromycin (0.5 µg/mL מבחר ותחזוקה של תא קו) בבקבוקון T75. דגירה. הבקבוק-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך יומיים. לפני תחילת הניסוי, בדוק המפגש של התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה.
הערה: התאים המשמשים את הניסוי הם מונצחים הסמפונות אפיתל תאי אדם transduced עם וקטור lentiviral היוועצות התנגדות puromycin. הם מבטאים stably תפקודית CFTR14,15. - לאחר זרימה התאים הגיעה 90-100%, תשאף האמצעי הבקבוקון ואת למחוק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה שימש כדי לקבוע את הפצע ריפוי אפקט Esc(1-21) ו- Esc(1-21) - 1 ג מבחינת פעילות ההעברה התאים המושרה בתאי אפיתל הסמפונות, המבטאת את CFTR פונקציונלי. ב הזה assay, תרבות מוסיף הונחו בבארות של צלחת 12-. ובכן, כל תא היה נזרע עם 35,000 בתאים MEMg בתוספת 10% FBS. התאים הגיעו למפגש מלא בתוך 24h. אחר כך, נוצר פער 500 μm, כל טוב היה מלא MEMg המכיל את פפטיד בריכוזים שונים. הניסוי היה בן ארבע פעמים. כמצוין באיור2, הסגר כמעט מוחלטת של השדה מדומים הפצע מיוצר על טפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נדידת תאים הוא תהליך חיוני באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כולל ריפוי הפצע, התפתחות של סרטן גרורות. ההליך הבסיסי לימודים תא העברה במבחנה כרוך: (i) היצירה של חד שכבתי תא, (ii) הייצור של פצע מדומה בשכבה confluent של תאים, הסגר (iii) לכידת תמונות במרווחי זמן שונים עד הפציעה נגיש , ו- (ד) הניתוח של רצף תמונות בכדי לכמת את מהירות ההעברה של התאים שבחרת.
התוצאות שלנו הראו כי היישום של תרבות מוסיף הוא אובייקטיבי ובלתי אמין ניסיוני טכניקת הערכה כמותית של מאפייני ההעברה תא. Assay זה יכול ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מימון ספיאנצה-אוניברסיטת רומא ועל קרן מחקר סיסטיק פיברוזיס איטלקי (פרוייקט טורבין #11/2014 שאומצה על ידי משלחות מועדון כדורגל מסיינה (siena), כולל Sondrio, Cerea Il Sorriso di ג'ני ו פאביה). חלק מעבודה זו נתמכה גם על-ידי FILAS FILAS פרוט גרנט-RU-2014-1020.
אנחנו אסירי תודה ד ר לורטה פררה (Genova מדיקה, Istituto ג'אנינה Gaslini, U.O.C. Genetica, איטליה) על מתן בתאי אפיתל הסמפונות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מדיום חיוני מינימלי (MEM) | Euroclone | ECB2071L | חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש |
| גלוטמין | Euroclone | ECB3000D | |
| סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| פניצילין וסטרפטומיצין | יורוקלון | ECB3001D | |
| פורומיצין | סיגמא-אולדריץ' | P8833 | |
| טריפסין/EDTA 1X ב-PBS | Euroclone | ECB3052D | לחמם בטמפרטורת החדר לפני השימוש |
| DPBS ללא סידן ומגנזיום (CMF-PBS) | סיגמא-אולדריץ' | D8537 | |
| DPBS עם סידן ומגנזיום (PBS) | סיגמא-אולדריץ' | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 באר | Ibidi | 80209 | |
| ניתוח תמונות Wimasis | Ibidi | 30002 | |
| תוכנת PRISM | GraphPad | גרסה 6.0 |
מקורות
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
