Summary
هذه المخطوطة وصف أسلوب يحفز مركز epilepticus بحقن pilocarpine النظمية ورصد عفوية النوبات المتكررة في الحيوانات الحية باستخدام القياس عن بعد اللاسلكية الفيديو والنظام الكهربائي. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الآليات باثوفيسيولوجيك الصرع المزمن، وابيليبتوجينيسيس، والنوبات الحادة.
Abstract
صرع الفص الصدغي (TLE) اضطراب عصبي مشتركة في مرحلة البلوغ. متعدية الجنسيات دراسات الصرع المزمن، كثيرا ما تحديد الوضع الناجم عن بيلوكاربيني ابيليبتيكوس (جنوب شرق) أن الخص عفوية النوبات المتكررة (SRS). نقدم هنا بروتوكولا لتحريض سراج الدين بالحقن داخل (القائمة) من بيلوكاربيني ورصد النوبات المتكررة المزمنة في الحيوانات الحية باستخدام القياس عن بعد الفيديو اللاسلكية ونظام للالكهربائي (EEG). وقد دللنا أبرز التغيرات السلوكية التي تحتاج إلى عناية بعد حقن pilocarpine وارتباطها مع فقدان الخلايا العصبية هيبوكامبال في 7 أيام و 6 أسابيع بعد انتهاء بيلوكاربيني. ونحن أيضا وصف الإجراءات التجريبية لزرع قطب كهربائي للفيديو وتسجيل EEG، وتحليل تواتر ومدة النوبات المتكررة المزمنة. وأخيراً، نحن نناقش الأسباب المحتملة لماذا لم تتحقق النتائج المتوقعة في كل حالة على حدة. وهذا يوفر نظرة عامة أساسية من النمذجة الصرع المزمن في الفئران، والمبادئ التوجيهية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن تخدم كأساس لنماذج مناسبة للصرع المزمن وابيليبتوجينيسيس.
Introduction
TLE واحد من ابيليبسيس المكتسبة الأكثر شيوعاً1. الناس المصابين بالصرع تجربة النوبات المتكررة نتيجة أنشطة الخلايا العصبية غير طبيعي في الدماغ2،3. TLE غالباً مستعصية على الحل، فإن من المهم لفهم الآليات الأساسية التي تقوم عليها تنمية الصرع.
يمكن أن تقدم نماذج حيوانية يمكن إيجاز الخصائص الرئيسية للبشرية TLE تقدير أفضل TLE الفيزيولوجيا المرضية، مما يسمح لنا برصد ومعالجة العوامل الحاسمة في ابيليبتوجينيسيس بسهولة. فيما بينها، كان سراج الدين الناجم عن تشيموكونفولسانتس تستخدم على نطاق واسع4،5. خلافا لنماذج أخرى من الصرع، مثل التحفيز الكهربائي الذي يظهر التصلب هيبوكامبال وقوية SRS6،،من78، لا يمكن أن تحاكي الجهازية حقن تشيموكونفولسانتس المرضية الإكلينيكية ل TLE البشرية، أيإصابة في الدماغ الأولية وفترة كامنة، وصرع مزمن مرحلة الإظهار SRS5،،من910. ولذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب في مختلف الدراسات التي تشرح آليات تلف الدماغ الحادة، ابيليبتوجينيسيس، أو قمع الاستيلاء. وعلاوة على ذلك، مماثلة لتلك التي ظهرت في TLE البشرية، توفير المبررات إضافية لاستخدام TLE نماذج القوارض10،،من1112نسيجية التعديلات الناجمة عن تشيموكونفولسانتس. جدير بالذكر أن الأضرار الهيكلية التي تنطوي الحصين قد استنسخ دائماً في كلا النموذجين حمض و pilocarpine--المستحثة SE كينك. ومع ذلك، مقارنة بحقن حمض كينك، طراز بيلوكاربيني يمكن أن تنتج SRS أكثر قوة في الفئران، التي يمكن أن توفر مزايا كبيرة لدراسة الصرع المزمن عند النظر في توافر واسعة من الماوس المعدلة وراثيا خطوط5، 13 , 14 , 15-علاوة على ذلك، تطور الاستيلاء بعد الحقن بيلوكاربيني عادة أسرع من أي وقت في نموذج حمض كينك، تقديم أدلة إضافية للاستخدام الفعال لنموذج بيلوكاربيني للصرع.
هنا، نبدي وسيلة لحمل سراج الدين بحقن القائمة pilocarpine وأداء الفيديو ورصد EEG في الصرع المزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التجريبية موافقة "لجنة الأخلاقيات" الجامعة الكاثوليكية في كوريا ونفذت وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 80-23).
1-SE التعريفي
- شراء عمرها 8 الأسبوع ذكور الفئران C57BL/6NHsd وتزن كل الماوس. ثم، استخدم قلم ماركر بمناسبة ذيول الفئران جميع التعرف السهل عليهم خلال الاستقراء سراج الدين.
- حساب كمية بروميد الميثيل السكوبولامين (سكوبولامين؛ 2 مغ/كغ)، هيميسولفاتي تربيوتالين (تربيوتالين؛ 2 مغ/كغ)، وهيدروكلوريد pilocarpine (pilocarpine؛ 280 ملغ/كغ) استناداً إلى وزن الماوس وإضافة المحلول الملحي (0.9% كلوريد الصوديوم، 10 مل/كغ) لجعل الحلول.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان وزن الماوس ز 25، يتم تطبيق المبالغ التالية: السكوبولامين وتربيوتالين: 2 مغ/كغ * (25 جرام/1,000 ز) = 0.05 مغ، المالحة: 10 مل/كغ * (25 جرام/1,000 ز) = 0.25 مل، بيلوكاربيني: 280 ملغ/كغ * (25 جرام/1,000 ز) = 7 مغ ، المالحة: 10 مل/كجم * (25 جرام/1,000 ز) = 0.25 مل. - تحميل الخليط السكوبولامين وتربيوتالين في حقنه 1 مل بإبرة 30 جرام. حقن الحل إينترابيريتونيلي كل الماوس، وثم العودة الفئران إلى اقفاصها. في 30 دقيقة بعد الإدارة سكوبولامين وتربيوتالين، حقن pilocarpine حل كل الماوس (القائمة؛ 1 مل حقنه إبرة 30 جرام). مباشرة بعد حقن pilocarpine، وضع الفئران في حاضنة (28-30 درجة مئوية) للمراقبة.
- مراقبة سلوك الفئران بعناية حتى فعل سراج الدين. إذا تم الكشف عن المضبوطات موتور الحوفي التي تتوافق مع المرحلة 3 أو أعلى وفقا لمقياس لراسين، سجل الوقت ورصد الفئران لتحديد ما إذا كانت المضبوطات تحدث بشكل متكرر أكثر. بمجرد مصادرة السيارات مستمر آخر أكثر من 2 دقيقة، ضع الماوس في قفص جديد في درجة حرارة الغرفة والحفاظ على رصد ح 3 لتحديد ما إذا كانت مواصلة هذه النوبات التشنجية وفعل سراج الدين. Euthanize الفئران التي فشلت في دخول سراج الدين في حوالي 2 ساعة بعد الحقن بيلوكاربيني.
ملاحظة: مقياس لراسين؛ المرحلة 1 والفم وحركة الوجه؛ المرحلة 2، رئيس الإيماء؛ المرحلة 3، رمع فوريليمب؛ المرحلة 4، تربية مع رمع فوريليمب؛ المرحلة 5، تربية والوقوع مع فوريليمب رمع16. إذا كان لا يتم نقل الماوس إلى القفص في درجة حرارة الغرفة فورا بعد التعريفي سراج الدين، يمكن أن يموت الماوس بسبب هايبرثيرميا. - إنهاء السلوكية مضبوطات الحادة في ح 3 بعد ظهور سراج الدين عن طريق حقن الديازيبام الحل (القائمة 10 مغ/كغ 1 مل حقنه; إبرة 30 جرام). جعل الحل الديازيبام بإذابة 5 ملغ/مل ديازيبام في زيت الخروع المهدرجة 35 بوليوكسيل 10% بإضافة المحلول الملحي (القائمة 10 مل/كغ 1 مل حقنه; إبرة 30 جرام).
ملاحظة: 10% بوليوكسيل 35 مهدرج زيت الخروع الحل: 1 مل بوليوكسيل زيت الخروع المهدرجة 35 الحل + 9 مل المحلول الملحي. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة. على سبيل المثال، إذا كان وزن الجسم الماوس ز 25، ضخ 250 ميليلتر من الديازيبام الحل: 50 ميليلتر ديازيبام 5 ملغ/مل + 200 ميليلتر المهدرجة بوليوكسيل 10% 35 الخروع زيت الحل = ميليلتر 250 1 ملغ/مل الديازيبام. - للفئران الشام، إجراء حقن القائمة في خليط هيميسولفاتي بروميد الميثيل وتربيوتالين السكوبولامين (القائمة؛ وكلا 2 مغ/كغ، 10 مل/كغ؛ ز 30 إبرة وحقنه 1 مل). 30 دقيقة في وقت لاحق، حقن المحلول الملحي إينترابيريتونيلي (القائمة 10 مل/كغ 1 مل حقنه; إبرة 30 جرام).
ملاحظة: إذا كان وزن الجسم الماوس ز 25، ضخ 250 ميليلتر من المحلول الملحي بدلاً من بيلوكاربيني. - بعد حقن الديازيبام (القائمة؛ 1 مل حقنه إبرة 30 جرام)، إدارة 1 مل الدكستروز 5% كل الماوس الفردية (القائمة؛ 1 مل حقنه الإبرة ز 26).
ملاحظة: 1 مل حقن الدكستروز 5% توفر مصدر للطاقة والماء التي يمكن أن تزيد من معدل البقاء على قيد الحياة. - وخلال مرحلة ما بعد الرعاية في الحاضنة (28-30 درجة مئوية)، تمحو المفرط إفرازات مثل اللعاب والدموع والبراز.
- في اليوم الأول بعد التعريفي سراج الدين، وزن الفئران والاحتفاظ بها في الحاضنة (28-30 درجة مئوية) لمدة يوم واحد إضافي. في اليوم الثاني، بعد التعريفي سراج الدين، وزن الفئران وإعادتهم إلى القفص المنزل. تقدم تشو رطبة لتسهيل انتعاشها.
ملاحظة: في هذه التجربة، كان معدل الوفيات ل C57BL/6NHsd بعد انتهاء SE 8.57 في المائة في المتوسط (3 إلى 35 فئران اختبار). - قياس وزن الجسم من الحيوانات يوميا حتى 7 أيام بعد انتهاء بيلوكاربيني وحقن الفئران مع الدكستروز 5% (القائمة؛ 1 مل حقنه الإبرة ز 26) عندما لم يزد وزن الجسم. إيقاف هيئة مراقبة الوزن عندما تبدأ الفئران في استعادة وزن الجسم وتستهلك تشاو رطبة دون صعوبة في يومين بعد الحقن بيلوكاربيني.
ملاحظة: إذا لم يؤد إلى زيادة وزن الجسم بالماوس حتى 7 أيام المنصب ذاته، استبعاد الماوس من التجربة و euthanize بثاني أكسيد الكربون. استناداً إلى هذه خلفية الماوس، يمكن أن تحدث الوفاة أحياناً؛ ومع ذلك، في حالة C57BL/6NHsd، توفي أقل من 1 في المائة فئران في هذه التجارب. مع البقاء على قيد الحياة لأكثر من 7 أيام بعد التعريفي سراج الدين، يموت الفئران إلا نادراً خلال الفترة الكامنة.
2-غرس جراحة لرصد EEG الفيديو
- إعداد الفئران عمرها 12 أسبوع (4 أسابيع بعد التعريفي SE) لإجراء زرع القياس عن بعد لرصد EEG.
ملاحظة: يمكن تعديل توقيت غرس تبعاً لأغراض تجريبية وسلالات الماوس. - قبل الجراحة، تخدير الماوس مع خليط (4:0.5) من الكيتامين (50 ملغم/مل) والحل إكسيلازيني (23.3 مغ/مل) المذابة في المحلول الملحي بجرعة 2.5 ميليلتر/غرام وزن الجسم (القائمة؛ 1 مل حقنه الإبرة ز 26). رصد معدل التنفس وجهد الجهاز التنفسي للماوس على فترات منتظمة (الفاصل الزمني 15 دقيقة كحد أقصى) وتقييم عمق التخدير عن طريق منعكس سحب الدواسة.
- ضع الماوس في إطار ستيريوتاكسيك مع أشرطة الإذن وصفيحة لدغة وتطبيق مرهم البيطرية في كلتا العينين لتجنب العمى.
- للحفاظ على ظروف معقمة أثناء الجراحة، يحلق المواقع الجراحية باستخدام شفرة حلاقة. كن حذراً لمنع تلوث الفراء من ميدان العمليات الجراحية. بعد الحلاقة، تطهير الجلد بحل 70% من الإيثانول واليود.
ملاحظة: وينبغي إجراء عملية جراحية بطريقة معقمة ارتداء قفازات معقمة وأقنعة، واستخدام معدات معقمة وتقنيات العقيم. - بعد تأكيد عمق التخدير، جعل شق خط الوسط للجلد لفضح الجمجمة. جعل اثنين من الثقوب لدغ مع حفر المرفقة بالجهاز ستيريوتاكسيك في الإحداثيات من بريجما في محور الصورة (أ فب): +0.1 مم، محور mediolateral (مل): +0.1 ملم (مرجع)، ووكالة اسوشييتد برس: −0.2 مم، مل: +0.22 ملم (القشرة الجدارية اليسرى)13.
- مسح البشرة بمبادلة القطن غارقة في برنامج تلفزيوني، وتليها حل 70% من الإيثانول واليود. جعل شق طولي في منتصف الرأس مع مقص لكشف لامدا (النقطة التي تلتقي فيها السهمي وخياطة لامبدويد)، بريجما (نقطة تقاطع لخياطة كرونال بخياطة السهمي)، وموقع الهدف.
- تحديد المعالم التشريحية مثل أمداً وبريجما. ضع مثقاب في بريجما وملاحظة X, Y إحداثيات لهذه النقطة.
- كتب أطلس الدماغ استخدام أو نشر المراجع لتحديد الإحداثيات المناسبة لمناطق الدماغ لتسجيل EEG. ثم، حساب إحداثيات للمسامير (مرجع وتسجيل) باستخدام إحداثيات بريجما تقاس في خطوة 2.5.2.
- انخفاض ببطء مثقاب جعل حفرة لدغ الحرص على تجنب إدراج مثقاب بعيدة جداً في النقطة التي يصبح فيها الجمجمة أرق.
- ويؤدي إدراج جسم قناة واحدة اللاسلكية الإرسال EEG خلف مؤخر العنق تحت الجلد ومكان مرنة قرب الجمجمة.
- ضع المسمار الفولاذ المقاوم للصدأ (طولها 2 مم) في كل حفرة لدغ بملاقط وتشديد عليه استخدام سائق المسمار بدوران مع عقارب الساعة. تأكد من أن لا يتم إدراج المسمار عميق جداً الآن عن طريق ضبط درجة الاستدارة المسمار من أجل منع إلحاق ضرر دوراً أو أنسجة المخ.
- قطاع معطف العزل 2 مم من طرف العملاء المتوقعين وتمتد الأسلاك طويلة بما يكفي جولة رمح المسمار لاتصال جيد بين السلك والمسمار. قم بتوصيل الرصاص إشارة المسمار الجبهة ويؤدي تسجيل إلى المسمار في القشرة الجدارية. ثم قم بتطبيق الأسمنت الأسنان لتأمين الجمعية بأسرها في مكان دون تعريض أجزاء معدنية.
- بعد التحقق من أن الأسمنت الأسنان قد جفت تماما بالفحص البصري، خياطة الجلد وتطبيق مرهم mupirocin الموضعية. ضع الماوس في حاضنة 30 درجة مئوية مفردها حتى أنه يتعافى من عملية جراحية (حوالي 30 دقيقة). ثم العودة الماوس إلى القفص المنزل حتى تبدأ رصد مستمر والفيديو-EEG.
ملاحظة: بعد الجراحة، يتم حقن كل الماوس (القائمة؛ 1 مل حقنه إبرة 30 جرام) مع 5 ملغ/كغ جنتاميسين (المضادات الحيوية) و 5 ملغ/كغ من كيتوبروفين (المسكنات). وينبغي رصد الحيوانات حتى تصبح حركيا كاملا. وقد مزروع الإرسال الفئران فترة نقاهة لأسبوع واحد تقريبا.
3-الفيديو ورصد EEG والتحليل
- ضع ماوس في أقفاص فردية ووضع القفص على رأس لوحات جهاز الاستقبال اللاسلكي المثبت من قفص فاراداي لتجنب انقطاع الإشارات الكهربائية من أي مصدر بما في ذلك جهاز كمبيوتر وخطوط التيار المتردد وأجهزة الاستقبال المجاورة.
ملاحظة: أرجع إلى دليل توفيرها من قبل الشركة المصنعة. ويجب الحرص على تجنب البقع العمياء. - سجل النشاط الكهربائي باستخدام نظام القياس EEG الفيديو اللاسلكية.
- قم بفتح البرنامج لتسجيل الفيديو-EEG. انقر فوق "الأجهزة"، ثم حدد "تحرير تكوين". تتطابق مع جهاز الاستقبال والإرسال مزروع في كل الماوس. انقر فوق "تكوين القناة" والتأكد من صحة جميع القنوات النشطة. انقر فوق "تكوين الفيديو" لمزامنة الفيديو مع بيانات التخطيط الدماغي (القرار 40 × 480 والإطار معدل 30.00).
ملاحظة: قم بتثبيت كاميرا الملكية الفكرية مع حساسية عالية إذا كان من الأهمية بمكان لجمع صورة جيدة الصفات التي يمكن التعرف على التغييرات السلوكية خفية من الفئران في الليل. - انقر فوق "إعداد" و "P3 الإعداد" لإدخال معلومات الحيوانات الفردية والكاميرا مطابقة إعداد الرسم البياني.
- انقر فوق "شراء" و "A/D معدل أخذ العينات" لإعداد معدلات أخذ العينات. انقر فوق "اسم مجموعة البيانات" لتعيين كل تجربة.
ملاحظة: معدل أخذ العينات للتخطيط الدماغي يجب أن يكون أعلى من 500 هرتز-بسبب الفيديو الكبيرة وحجم البيانات EEG, من المستحسن إلا يتم التعامل مع ح 24 من البيانات في الدورة الواحدة بدلاً من استخدام مستمر 2-أسبوع-تسجيل كملف واحد. يمكن حفظ البيانات بشكل منفصل على فترات 8 h أو 12 h في حالة نقص الذاكرة RAM. - تنشيط جهاز الإرسال مع شريط مغناطيسي، وانقر فوق "بدء اكتساب" جمع تسجيل الفيديو-EEG. ترصد باستمرار الماوس بنظام الفيديو-EEG لمدة أسبوعين على الأقل.
ملاحظة: للفئران C57BL/6، SRS تميل إلى الحدوث في مجموعات يوما آخر حوالي 5.2 ومدة فترة خالية من مصادرة هو حوالي 6.7 أيام17.
- قم بفتح البرنامج لتسجيل الفيديو-EEG. انقر فوق "الأجهزة"، ثم حدد "تحرير تكوين". تتطابق مع جهاز الاستقبال والإرسال مزروع في كل الماوس. انقر فوق "تكوين القناة" والتأكد من صحة جميع القنوات النشطة. انقر فوق "تكوين الفيديو" لمزامنة الفيديو مع بيانات التخطيط الدماغي (القرار 40 × 480 والإطار معدل 30.00).
- تحديد تواتر الاستيلاء ومدة بالتفتيش اليدوي باستخدام البرمجيات التحليل.
- علامة منطقة عرض استراتيجية الاعتماد على الذات، وتصدير البيانات للتحليل الإحصائي. توخي الحذر لاستبعاد EEG القطع الأثرية التي يمكن إنشاؤها بواسطة حك الرأس أو مضغ؛ وهذه يمكن إزالتها عن طريق التحقق من بيانات الفيديو.
ملاحظة: يعرف SRS المفاجئة لتكرار صرعية التشويك النشاط (≥ 3 هرتز) التي استمرت لأكثر من 10 من السلوكيات التشنجية س. يمكن أن يرافق كثيرا مع انفجار من النتوءات النشاط. يمكن إظهار النوبات التشنجية عدم أيضا أنشطة التشويك اليكتروجرافيك دون السلوكيات التشنجية. ويعرف إنهاء الاستيلاء التي تحدث عند إطلاق المسامير العودة إلى النشاط الأساس. - لمزيد من التحليل للاستيلاء على التردد، تقسيم العدد الإجمالي للحالات SRS اكتشفت خلال الأسابيع 2 بالعدد الإجمالي لأيام التسجيل لكل الحيوانات الفردية.
- لمزيد من التحليل لمدة الحجز، قياس الوقت من البداية لنهاية صرعية التشويك الأنشطة.
- علامة منطقة عرض استراتيجية الاعتماد على الذات، وتصدير البيانات للتحليل الإحصائي. توخي الحذر لاستبعاد EEG القطع الأثرية التي يمكن إنشاؤها بواسطة حك الرأس أو مضغ؛ وهذه يمكن إزالتها عن طريق التحقق من بيانات الفيديو.
- بعد انتهاء تسجيل الفيديو-EEG، إصلاح الدماغ مع بارافورمالدهيد 4% من نضح ترانسكارديال. لتخدير الماوس، حقن محلول (4:0.5) من الكيتامين (50 ملغم/مل) وإكسيلازيني (23.3 مغ/مل) المذابة في المحلول الملحي بجرعة 10 ميكروليتر/غرام وزن الجسم (القائمة؛ 1 مل حقنه الإبرة ز 26). مجرد تأكيد الماوس يتم تخديره عميق، أداء نضح ترانسكارديال.
- قبل عزل الدماغ الماوس، استرداد جهاز الإرسال من الماوس لإعادة استخدامها بعد التطهير.
- إزالة الأسمنت الأسنان حول العملاء المتوقعين باستخدام الملقط.
- نقع غيض من العملاء المتوقعين بالأسمنت الأسنان في الأسيتون 100% حتى يذوب الأسمنت الأسنان.
- إزالة الملوثات الأنسجة حول جهاز الإرسال قبل الشطف مع الماء المقطر.
- شطف الإرسال مع الإيثانول 70% 3 ح والهواء الجاف فإنه للتخزين. مباشرة قبل استخدام القادم، شطف المسمار والإرسال مع الإيثانول 70%، متبوعاً بالماء المقطر، ووضعها في المياه المالحة.
ملاحظة: ويجب الحرص على تجنب قطع الأسلاك المرنة عندما قطع رأس الماوس منذ ذلك الحين، إذا كان العملاء المتوقعين مرنة قصيرة جداً، والضوضاء في غرس القادم وتسجيل الفيديو--EEG قد يزيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SE ناجحة يمكن أن يستحث موت الخلية هيبوكامبال واستراتيجية الاعتماد على الذات (الشكل 1 و الشكل 2). علينا إنهاء مضبوطات الحادة السلوكية بحقن الديازيبام في ح 3 بعد ظهور سراج الدين والتضحية الفئران 7 أيام أو 6 أسابيع في وقت لاحق.
لرصد الفيديو-EEG، الفئران تلقت زرع جراحة في 4 أسابيع بعد سراج الدين، وتم تقييم الحالات SRS لمدة أسبوعين من 5-7 أسابيع بعد ظهور سراج الدين.
ويبين الشكل 1 وفاة الخلية في الحصين يقيمها تلطيخ كريسيل البنفسجي. في 7 أيام بعد سراج الدين، تم الكشف عن خلايا متنكرزه على في مناطق تضخم (الشكل 1الإعلانية) المغزلي المسنن وطبقة الخلايا الهرمية حقلاً فرعياً CA3 الحصين (الشكل 1Af)، في حين لوحظ الحصين سليمة في الحيوانات الشام حقن المحلول الملحي بدلاً من بيلوكاربيني (الشكل 1ألف-ج). من المثير للاهتمام، فشل الحيوانات الذي خضع لمضبوطات متعددة، لكن أدخل ذاته، أظهرت لا موت الخلية في منطقة تضخم أو طبقة الخلايا الهرمية (الشكل 1Ag-ط). في 6 أسابيع بعد سراج الدين، لوحظ انخفاض ملحوظ في عدد الخلايا تضخم (الشكل 1Bm). وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ فقدان الخلايا العصبية في CA1 (الشكل 1مليار) و CA3 المناطق (الشكل 1بو).
ويبين الشكل 2 آثار التخطيط الدماغي الممثل في الشام ومجموعات سراج الدين (الشكل 2أ). مقارنة بالمجموعة الشام عرض النشاط الكهربائي الفيزيولوجي، أظهر الفريق سراج الدين أحياناً التصريفات صرعية مصحوبة بسلوكيات التشنجية. ويوضح الشكل 2جمواقع الأقطاب فوق الجافية. الشكل 2 ب يوضح مثال عن الضوضاء الكهربائية من جهاز المتاخمة، وفشل جمع إشارة. كما أثبتنا آثار EEG للحيوانات التلاعب الشام الذين أظهرت مضبوطات عفوية خلال الأسبوعين تسجيل الفيديو-EEG (الشكل 2ه) والعثور على إصابات القشرية في التروية، ربما المستمدة من موضع عميق مفرطة من مسامير فوق الجافية (الشكل 2د).
الشكل 1 : وفاة الخلايا العصبية في قرن آمون بعد المستحثة pilocarpine سراج الدين- صور الممثل من المجموعات من (أ) 7 أيام و (ب) 6 أسابيع بعد الحقن بيلوكاربيني أو المالحة. إظهار الصور المكبرة نقير (، ي)، CA1 حقلاً فرعياً (ب، ك)، وحقلا فرعياً CA3 (جو ل) من مجموعة الشام معاملة المياه المالحة، نقير (د، م)، CA1 حقلاً فرعياً (e, n) ، وحقلا فرعياً CA3 (و، س) مجموعة سراج الدين، وفي نقير (ز)، CA1 حقلاً فرعياً (ح)، وفروع CA3 (أنا) من الفئران التي لا تتطور السهام ذاتها الأسود في و gو j وتشير إلى بعض الخلايا تضخم الممثل، ورؤوس أسهم في د وم تشير إلى الخلايا متنكرزه. مقياس بار في الأسفل الجانب الأيسر = 200 ميكرومتر، صالحة لكامل غادر معظم العمود، شريط مقياس في وج = 20 ميكرومتر، صالحة للعمود الأوسط بأكمله والعمود الأيسر. المختصرات في هذا الرقم: CA1، CA3: "أمونيس قرن" هيبوكامبال الفروع؛ المديرية العامة: المغزلي المسنن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تسجيل الفيديو والتخطيط الدماغي يظهر عفوية النوبات المتكررة في الماوس الصرع. آثار الممثل EEG (A) من الشام-(أعلى) والتلاعب SE الحيوانات (أسفل). ويلاحظ أن سراج الدين تعرض الحيوانات تبين صرعية التشويك النشاط (≥ 3 هرتز)، وعدم المشاركة بالحيوانات الشام. (ب) صورة تمثيلية الضوضاء الكهربائية، وعدم جمع إشارة. ملاحظة المسامير عالية السعة أحادي القطب ووقف إشارات كهربائية. (ج) التخطيطي رسم المخ الماوس مع مواقع الأقطاب الكهربائية. (د) اثنين صور تظهر سليمة وإصابة المخ في القشرة، ربما بسبب الإدراج العميقة مفرطة من مسامير فوق الجافية. يشير السهم الأسود في الصورة الصحيحة إلى الموقع الضرر القشرية. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. (ه) "التخطيط الدماغي الممثل" آثار التلاعب الشام الحيوانات مع أو بدون إصابة في الدماغ. لاحظ أن التلاعب الشام الحيوانات القشرية إصابة إنشاء نشاط التشويك والتشنجيه SRS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويصف هذا العمل الإجراءات التجريبية لاستحثاث سراج الدين والتقييم لمضبوطات المزمنة.
عدة عوامل يمكن أن تؤثر على نجاح توجيهي سراج الدين. دقة الرصد السلوكي طبقاً لمقياس رأسين أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجية الاعتماد على الذات. رئيس الإيماء، رمع فوريليمب، تربية، وتقع هي السمة المميزة السلوكية من مضبوطات الحادة إلى مرحلة SE4،16. حالما يتم الكشف عن مصادرة السيارات الأولى، يقلل طول الفاصل الزمني بين النوبات التشنجية في وقت لاحق قبل الدخول في حد ذاتها. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يستمر سراج الدين على الأقل 6 ح ما لم يتم إنهاء مضبوطات السلوكية من الديازيبام5. تجدر الإشارة إلى أن الباحثين ينبغي أن تدرك إمكانية أن يستمر الحجز ويمكن الكشف عن أنشطة عبر اليكتروكورتيكوجرامس، على الرغم من أن المضبوطات السلوكية ويبدو أن تهدأ مع حقن الديازيبام. زيادة درجة الحرارة المحيطة بعد حقن pilocarpine حتى التعريفي سراج الدين يمكن أن تحسن كثيرا من عدد الحيوانات بحد ذاتها. كما أن من المهم توفير الرعاية ما بعد الاستيلاء المكثفة، بما في ذلك الماء الكافي والدعم الغذائي والوزن الرصد لارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة من حوالي 70-80% في المتوسط5،18. اعتماداً على الخلفية الوراثية للحيوان، وقد تختلف قابلية بيلوكاربيني. إذا كان عرض الحيوانات مضبوطات الحادة الشديدة مع ارتفاع معدل الوفيات، الحد من جرعة pilocarpine ومدة سراج الدين، أو زيادة السكوبولامين وتربيوتالين يمكن أن تكون مفيدة. بينما SE الشديد المعروف أن الإصابة ذات الصلة إلى أعلى من استراتيجية الاعتماد على الذات، مع ارتفاع نسبة الوفيات، من الأهمية بمكان النظر في هذه العوامل. ولوحظت موت الخلايا العصبية هيبوكامبال دائماً بعد سراج الدين. في وظيفة ح 6-SE، كانت خسائر فادحة من تضخم إينتيرنيورونس عنها19. عادة الخلايا العصبية الهرمية في فروع CA3 7 أيام بعد سراج الدين، يموت، ولوحظت بشكل مستمر في 6 أسابيع بعد التعريفي سراج الدين، على الرغم من أن حجم الأضرار العصبية في طبقة الخلايا الهرمية متغير في الفئران. ويمكن أيضا كثيرا ما لوحظ فقدان الخلايا العصبية في CA1 حقلاً فرعياً الحصين. من المثير للاهتمام، من الحيوانات مع المضبوطات متعددة الذين لم تقم بإدخال سراج الدين أظهر الحصين سليمة تقريبا مشابهة لمجموعة الشام، مما يشير إلى موت الخلايا النسجية يمكن أن يكون علامة جيدة على النوبات الحادة الشديدة بما فيه الكفاية.
في حوالي الساعة 4 بعد أسابيع من سراج الدين، جميع الفئران C57BL/6NHsd التعامل مع pilocarpine أصبح الصرع وأظهرت استراتيجية الاعتماد على الذات، مما يدل على أحد أهم جديرة باستخدام هذا النموذج. حيث تتجمع النوبات المزمنة، الفيديو-التخطيط الدماغي ينبغي أن تسجل بشكل مستمر لمدة أسبوعين على الأقل وليس بشكل متقطع، على الرغم من أن فترة التسجيل يمكن تعديلها تبعاً لسلالات الماوس أو أغراض تجريبية17. وعلاوة على ذلك، قد مضبوطات عفوية في TLE الاختلافات الدافيء مما يدل على ارتفاع وتيرة SRS في وقت متأخر بعد ظهر اليوم20. عمليا، تحتاج أي مصادر بما في ذلك خطوط التيار المتردد أو أجهزة الكمبيوتر أو الكاميرات أو مرسلات مزروع في الماوس في جهاز الاستقبال المتاخمة لتسجيل الفيديو-التخطيط الدماغي دقيق، يكون قد تم حظره. تركيب قفص فاراداي وكاميرات مع حساسية عالية أثناء النهار والليل يمكن أن يقلل من الضوضاء الكهربائية والمساعدة على تحديد المعمم النوبات المزمنة، على التوالي. وأخيراً، أنها بالغة الأهمية لتفادي تلف الدماغ عند وضع المسامير على السطح لآلام الجافية كما يمكن أن تولد بيانات التخطيط الدماغي مضللة. على الرغم من أن وتيرة SRS لم تكن عالية، يمكن أن تولد أي إصابات القشرية الميكانيكية بالإدراج المسمار القسري النوبات التشنجية في أسبوع واحد فقط.
وفي الختام، رغم الوقت زرع المعوقات للنمذجة ومتطلبات تدريب متعمق لإجراء العمليات الجراحية وتحليل التخطيط الدماغي، سراج الدين الناجم عن بيلوكاربيني واحد من أفضل النماذج لدراسة الصرع المزمن بين الحيوانات المتوفرة حاليا نماذج TLE. هنا، نحن تصف طريقة لسراج الدين حمل بعد الحقن بيلوكاربيني وتقييم مضبوطات المزمن باستخدام نظام التخطيط الدماغي فيديو لاسلكية القياس عن بعد. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن توفر معلومات تفصيلية حول نماذج حيوانية مناسبة للصرع المزمن وابيليبتوجينيسيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل ودعم المنح الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) التي تمولها "الحكومة الكورية" (جبهة الخلاص الوطني-2014R1A1A3049456) ومنحة من كوريا الصحة التكنولوجيا والتطوير د المشروع من خلال كوريا الصحة الصناعة تطوير معهد (خيدي)، وتمول وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (HI15C2854).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 | Envigo | C57BL/6NHsd | |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma | S2250 | Make 10X stock |
| Terbutaline hemisulfate salt | Sigma | T2528 | Make 10X stock |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Ketamine hydrochloride | Yuhan corporation | ||
| Xylazine hydrochloride | Bayer Korea | ||
| Diazepam | SAMJIN | ||
| Castor oil (Kolliphor EL) | Sigma | C5135 | Polyoxyl 35 hydrogenated castor oil |
| Saline | Daihan pharm. Co. | ||
| 5% Dextrose | Daihan pharm. Co. | ||
| Iodine solution (Povidin) | Firson | ||
| vet ointment (Terramycin) | Pfizer | ||
| Blue Nylon | AILEE | NB617 | |
| Mupirocin (Bearoban) | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Ketoprofen | Samchundang Pharm. Co., Ltd | 5 mg/kg | |
| Gentamicin | Huons, Ltd. | 5 mg/kg | |
| 1 mL syringe | Sung shim medial Co., Ltd. | ||
| 26 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 26 G * 13 mm (1/2") | |
| 30 guage needle | Sung shim medial Co., Ltd. | 30 G * 13 mm (1/2") | |
| Razor blade | Dorco | ||
| Drill | Saeshin precision Co., Ltd. | 207A, 35K (speed) | |
| Telemetry video/EEG system | Data sciences International. Inc. | Version 5.20-SP6 | |
| Implantable transmitter | Data sciences International. Inc. | ETA-F10 | |
| Screw | Sungho Steel | M1.4, 2 mm length stainless steel | |
| Vertex dental material | Dentimex | ||
| Acetone | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | CAS 67-64-1 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | millipore | 1.04005.1000 | 4 % |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 30 % solution in 0.01 M PBS |
| Cresyl violet acetate | Sigma | C5042 | |
| Ethanol | EMD Millipore Co. | UN1170 | |
| xylene | Duksan pure chemicals Co., Ltd. | UN1307 | |
| Acetic acid glacial | Junsei chemical | 31010-0350 | |
| FSC33 Clear | Leica biosystems | OCT compound for tissue freezing | |
| DPX Mounting for histology | Sigma | 6522 | |
| Forceps | Fine science tools | 11002-12 | |
| Scissors | Solco biomedical | 02-2445 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | E51070012 |
References
- Chang, B. S., Lowenstein, D. H. Epilepsy. N Engl J Med. 349 (13), 1257-1266 (2003).
- Scharfman, H. E.
- Rakhade, S. N., Jensen, F. E. Epileptogenesis in the immature brain: emerging mechanisms. Nat Rev Neurol. 5 (7), 380-391 (2009).
- Cavalheiro, E. A. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 16 (1-2), 33-37 (1995).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Morimoto, K., Fahnestock, M., Racine, R. J. Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Prog Neurobiol. 73 (1), 1-60 (2004).
- Levesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 37 (10), 2887-2899 (2013).
- Sharma, A. K., et al. Mesial temporal lobe epilepsy: pathogenesis, induced rodent models and lesions. Toxicol Pathol. 35 (7), 984-999 (2007).
- Hellier, J. L., Dudek, F. E. Chemoconvulsant model of chronic spontaneous seizures. Curr Protoc Neurosci. 9, Chapter 9 Unit 9 19 (2005).
- Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Molecular and cellular basis of epileptogenesis in symptomatic epilepsy. Epilepsy Behav. 14, Suppl 1 16-25 (2009).
- Mathern, G. W., Adelson, P. D., Cahan, L. D., Leite, J. P. Hippocampal neuron damage in human epilepsy: Meyer's hypothesis revisited. Prog Brain Res. 135, 237-251 (2002).
- Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
- Brulet, R., Zhu, J., Aktar, M., Hsieh, J., Cho, K. O. Mice with conditional NeuroD1 knockout display reduced aberrant hippocampal neurogenesis but no change in epileptic seizures. Exp Neurol. 293, 190-198 (2017).
- Cho, K. O., et al. Aberrant hippocampal neurogenesis contributes to epilepsy and associated cognitive decline. Nat Commun. 6, 6606 (2015).
- Cavalheiro, E. A., Santos, N. F., Priel, M. R. The pilocarpine model of epilepsy in mice. Epilepsia. 37 (10), 1015-1019 (1996).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
- Hester, M. S., Danzer, S. C. Accumulation of abnormal adult-generated hippocampal granule cells predicts seizure frequency and severity. J Neurosci. 33 (21), 8926-8936 (2013).
- Shibley, H., Smith, B. N. Pilocarpine-induced status epilepticus results in mossy fiber sprouting and spontaneous seizures in C57BL/6 and CD-1 mice. Epilepsy Research. 49 (2), 109-120 (2002).
- Borges, K., et al. Neuronal and glial pathological changes during epileptogenesis in the mouse pilocarpine model. Exp Neurol. 182 (1), 21-34 (2003).
- Pavlova, M. K., Shea, S. A., Bromfield, E. B. Day/night patterns of focal seizures. Epilepsy Behav. 5 (1), 44-49 (2004).
